蛋白质定量实验方法大全
互联网
- 相关专题
- LOWRY法蛋白定量专题
蛋白质定量貌似简单的实验，其实还是有一些学问的，蛋白质测定的方法有很多种，到目前为止还没有哪种方法符合大众所有的要求的，本文总结了Bradford斑点试验、Coomassie 斑点试验、紫外分光度检测法以及BCA法.
一、Bradford法
该方法用于大多数蛋白质定量是相当精确的，特别是用于小分子多肽定量。如核糖核酸酶 或溶菌酶等。但是，去污剂的浓度超过0.2%则影响定量结果。如TritonX-100，SDS，NP-40等。
1. Bradford染液配制：将100mg考马斯亮蓝溶于50 ml 95%的乙醇中，加入100ml 浓磷酸，然后，用双蒸水补充至200ml，放4C至少6个月。
2. 作标准曲线的蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准蛋白，例如进行抗体定量，可用纯化的抗体作为标准蛋白。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20μg-150μg/100μl之间绘制标准曲线。
3. 将待测样本溶于100μl缓冲溶液中，该缓冲溶液应于作标准曲线的缓冲溶液相同;
4. 按1：5用双蒸水稀释浓染料结合溶液，过滤离心沉淀物;
5. 每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5-30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，即可在595nm光波长下测定其吸光度。注意，颜色反应不得超过30min;
6. 应用标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：应用Bradford法测定BSA 的值是其重量的两倍。
二、Bradford斑点试验
该方法特别适用于检测洗脱组分，以定位蛋白洗脱液。例如检测洗脱液的吸附力的强弱。
1. 首先，浓缩Bradford染液。将100mg考马亮蓝溶于50 ml 95%的乙醇中，加入100ml 浓磷酸，然后，用双蒸水补充至200ml，放4C至少6个月。这种染液也可从Bio-Rad公司购到;
2. 将8μl待测蛋白质样本转移至一 条Parafilm，Saran Wrap上或微孔板孔中。同时应设一洗脱液样本作为空白对照;
3. 每个样本孔中加2μl浓Bradford染液并混匀;
4. 大约2min后，含有蛋白质的样本将变蓝。该方法的灵敏度约为10μg/ml。此反应对去污剂的浓度超过0.2%时非常敏感。但KCl，NaCl，MgCl2 或EDTA 对其无影响，Tris对其仅有轻微的影响。
三、Coomassie 斑点试验
该方法特别适用于检测洗脱组分以定位蛋白洗脱液。例如检测洗脱液的吸附力的强弱。
1. 裁剪3MM厚的Whatman 纸约4mm2 ;
2. 每个样本点5μl于Whatman 纸上;
3. 自然干燥样本或用电吹风吹干斑点，约1min或更少;
4. 将纸块浸入0.25%的考马斯亮蓝溶液中(考马斯亮蓝溶于10%的甲醇，7%醋酸中) 30min;
5. 将纸块放入10%的甲醇，7%醋酸溶液中洗涤3-5 min，然后干燥。
四、紫外分光度检测法
蛋白质紫外光吸光率是所有的蛋白质定量方法中最快的方法。通常在280nm光波长下读数。其在280nm光波长下的最大吸光率主要处决于酪氨酸和色氨酸的存在。在205nm光波长的吸收也常用到。其在205nm光波长下的最大吸光率主要处决于肽链，尽管氨基酸也有影响。另外，一个主要的优点是在测定蛋白质浓度时，样本不会遭到损害。
1、纯蛋白质溶液：
① 在280nm光波长下读取与适当的对照相比较的吸光率;
② 对于抗体和BSA ，可应用下表计算其浓度对其他蛋白质可粗约地估计：1个单位吸光率相当于1mg/ml。
蛋白质 A280 (1mg/ml)
IgG 1.35
IgM 1.2
BSA 0.7
2、含有核苷酸的蛋白质溶液
① 在280nm和260nm或280nm和205nm光波长下读取与适当的对照相比较的吸光率;
② 用下列等式粗略计算其浓度：
蛋白质浓度(mg/ml)=(1.55×A280 )-(0.76×A260 )
蛋白质浓度(mg/ml)= A205 /(27 + 120 A280/ A205 )
五、BCA法：
<center> </center>由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.28mg/ml
BCA法特点： 1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。 2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。 3. 在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。 4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。 5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mM
BCA法和Commassie法各有优势，在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用，以消除定量的误差。
Bradford法、Coomassie 法、紫外分光度检测法以及BCA法各有优缺点，要根据实验的目的去选择合适的蛋白定量方法，主要依据是缓冲液的化学组成和待测的蛋白的浓度。
