材料与仪器
鼠抗-σ32 单克隆抗体 辣根过氧化酶共价标记的羊抗鼠免疫球蛋白 G ECLTM#1 和#2 试剂 十二烷基肌氨酸钠 Tris-缓冲盐溶液
硝酸纤维素膜 斑点印迹装置 ECLTMHYPERFILM或柯达 X 光底片缓冲液 A
硝酸纤维素膜 斑点印迹装置 ECLTMHYPERFILM或柯达 X 光底片缓冲液 A
步骤
材料与设备
样品，由各步纯化操作所得
硝酸纤维素膜 (0.45um，8x11.5 cm)(Schleicher&Schuell，Inc+)
斑点印迹装置（MinifolundefinedI，Schleicher&Schuell，Inc.27510)
鼠抗-σ32 单克隆抗体 3RH2(MAb3RH2)
辣根过氧化酶共价标记的羊抗鼠免疫球蛋白 G(IgG-HRP)(AmershamLifeScience，Inc.)
ECLTM#1 和#2 试剂（AmershamLifeScience，Inc)
ECLTMHYPERFILM(AmershamLifeScience,Inc,) 或柯达 X 光底片
试剂
缓冲液 A
十二烷基肌氨酸钠 (SKL)(20% 储存溶液)
Tris-缓冲盐溶液 (TBS)
TBS+0.1% 吐温-20(TBST; 防止非特异性蛋白质的结合)
TES+1% 牛血清白蛋白 (BSA)
(配方, 见“试剂的配制”，PP.184~189)
操作程序
1) 按下述方案，将各步纯化所得的最重要祥品配制成一个倍比稀释系列。各样品取 20ul 加入 180ul 缓冲液 A+0.3%SKL 中进行稀释。充分混匀后，各稀释液取 100ul 加于 100ul 缓冲液 A(―个稀度换 1 个吸头), 依次连续 8 次倍比稀释。倍比稀释可方便地在微量滴定板上进行，微量滴定板在使用前每个孔均先经 100 的 TBS+1%BSA 孵育 10 min 进行封闭并用 TBST 冲洗。每个样品 8 个孔，分别加稀释 20、40、80、160、320、640、1280 和 2560 倍的稀释液。需要分析的组分样品有：样品 A(粗制溶菌产物)、样品 B(0.2%DOC 上清)、样品 C(第一次 2%DOC 清洗液)、样品 D(溶于 SKL 的包涵体)、样品 E(FEI 上清)、样品 F(0.3mol/LNaCl 清洗液)、样品 G(0.9mol/LNaCl 洗脱物)、样品 I〔免疫亲和层析（IAC) 上柱样品〕、IAC 柱的 3 号管组分、样品 J(经透析的 SKL 提取物）、POROS 50Q 柱的峰组分和已知浓度的σ32 标准（~0.5 mg/ml)。
注：用缓冲液 A+0.3%SKL 进行第一次稀释是为了溶解样品 A 中的包涵体。包涵体不溶解可导致σ32 与溶液隔离，根据我们的经验，这会使样品 A 中的σ32 量估低 8 倍！
2) 预湿硝酸纤维素膜，先在 Milli-Q 纯水器制备的水中预湿 2 min, 再在 TBS 中湿 5 min。安装斑点印迹装置，确保夹板安装得很严密，使样品不会从一加样孔漏至另一加样孔（先放一张矩形滤纸，再放一张矩形硝酸纤维素膜)。
3) 各稀释液（20 倍至 2560 倍）取 40ul 加入相应的加样孔（对一稀释系列，若从最稀的开始加样，可不换吸头)。静置 3 min, 缓慢抽真空。再用 100ul TBST 洗 3 次（加液时停止抽真空然后再开启)。
4) 从印迹装置取出硝酸纤维素膜。在 TBS+1%BSA 中孵育 30 min, 然后在 14 ml—抗溶液（14 ml TBS+1%BSA 和 5ulMAb 3RH2) 中孵育 1 h。倾出 MAb 溶液，存放于 4°C，数日内可重复使用。
5) 用 TBST 洗硝酸纤维素膜 4 次，每次 5 min。
6) 硝酸纤维素膜在 14 ml 二抗溶液（14 mlTBS+1%BSA 和 7ul 羊抗鼠 IgG-HRP) 中孵育 lh。倾出二抗溶液，保存以备再用。用 TBST 洗硝酸纤维素膜 4 次，每次 5 min。
7) 将 7 ml ECL#1 试剂和 7 ml ECL#2 试剂混合（即,0.15 ml 混合物/cm2 硝酸纤维素膜并倾至滤膜上。混匀，孵育 1 min, 然后弃去多余的试剂。将硝酸纤维素膜包在 Saran 包装膜中。使 ECL Hyperfilm 曝光 2、10 和 60s。底片显影 (放在显影液中 2 min, 用水漂洗 0.5 min, 再放在定影液中 2 min, 用水漂洗 10 min)。晾干底片。
8) 底片用扫描定量或目测估计，比较各样品的哪个稀度所显示的信号与标准品的相当。例如，若σ32 标准品在 640 倍稀度显示中等密度的信号，而样品 D 在 1280 倍稀度显示同等的密度，则可估算出样品 D 的浓度为σ32 标准品的两倍 (见图 3-4)。
样品，由各步纯化操作所得
硝酸纤维素膜 (0.45um，8x11.5 cm)(Schleicher&Schuell，Inc+)
斑点印迹装置（MinifolundefinedI，Schleicher&Schuell，Inc.27510)
鼠抗-σ32 单克隆抗体 3RH2(MAb3RH2)
辣根过氧化酶共价标记的羊抗鼠免疫球蛋白 G(IgG-HRP)(AmershamLifeScience，Inc.)
ECLTM#1 和#2 试剂（AmershamLifeScience，Inc)
ECLTMHYPERFILM(AmershamLifeScience,Inc,) 或柯达 X 光底片
试剂
缓冲液 A
十二烷基肌氨酸钠 (SKL)(20% 储存溶液)
Tris-缓冲盐溶液 (TBS)
TBS+0.1% 吐温-20(TBST; 防止非特异性蛋白质的结合)
TES+1% 牛血清白蛋白 (BSA)
(配方, 见“试剂的配制”，PP.184~189)
操作程序
1) 按下述方案，将各步纯化所得的最重要祥品配制成一个倍比稀释系列。各样品取 20ul 加入 180ul 缓冲液 A+0.3%SKL 中进行稀释。充分混匀后，各稀释液取 100ul 加于 100ul 缓冲液 A(―个稀度换 1 个吸头), 依次连续 8 次倍比稀释。倍比稀释可方便地在微量滴定板上进行，微量滴定板在使用前每个孔均先经 100 的 TBS+1%BSA 孵育 10 min 进行封闭并用 TBST 冲洗。每个样品 8 个孔，分别加稀释 20、40、80、160、320、640、1280 和 2560 倍的稀释液。需要分析的组分样品有：样品 A(粗制溶菌产物)、样品 B(0.2%DOC 上清)、样品 C(第一次 2%DOC 清洗液)、样品 D(溶于 SKL 的包涵体)、样品 E(FEI 上清)、样品 F(0.3mol/LNaCl 清洗液)、样品 G(0.9mol/LNaCl 洗脱物)、样品 I〔免疫亲和层析（IAC) 上柱样品〕、IAC 柱的 3 号管组分、样品 J(经透析的 SKL 提取物）、POROS 50Q 柱的峰组分和已知浓度的σ32 标准（~0.5 mg/ml)。
注：用缓冲液 A+0.3%SKL 进行第一次稀释是为了溶解样品 A 中的包涵体。包涵体不溶解可导致σ32 与溶液隔离，根据我们的经验，这会使样品 A 中的σ32 量估低 8 倍！
2) 预湿硝酸纤维素膜，先在 Milli-Q 纯水器制备的水中预湿 2 min, 再在 TBS 中湿 5 min。安装斑点印迹装置，确保夹板安装得很严密，使样品不会从一加样孔漏至另一加样孔（先放一张矩形滤纸，再放一张矩形硝酸纤维素膜)。
3) 各稀释液（20 倍至 2560 倍）取 40ul 加入相应的加样孔（对一稀释系列，若从最稀的开始加样，可不换吸头)。静置 3 min, 缓慢抽真空。再用 100ul TBST 洗 3 次（加液时停止抽真空然后再开启)。
4) 从印迹装置取出硝酸纤维素膜。在 TBS+1%BSA 中孵育 30 min, 然后在 14 ml—抗溶液（14 ml TBS+1%BSA 和 5ulMAb 3RH2) 中孵育 1 h。倾出 MAb 溶液，存放于 4°C，数日内可重复使用。
5) 用 TBST 洗硝酸纤维素膜 4 次，每次 5 min。
6) 硝酸纤维素膜在 14 ml 二抗溶液（14 mlTBS+1%BSA 和 7ul 羊抗鼠 IgG-HRP) 中孵育 lh。倾出二抗溶液，保存以备再用。用 TBST 洗硝酸纤维素膜 4 次，每次 5 min。
7) 将 7 ml ECL#1 试剂和 7 ml ECL#2 试剂混合（即,0.15 ml 混合物/cm2 硝酸纤维素膜并倾至滤膜上。混匀，孵育 1 min, 然后弃去多余的试剂。将硝酸纤维素膜包在 Saran 包装膜中。使 ECL Hyperfilm 曝光 2、10 和 60s。底片显影 (放在显影液中 2 min, 用水漂洗 0.5 min, 再放在定影液中 2 min, 用水漂洗 10 min)。晾干底片。
8) 底片用扫描定量或目测估计，比较各样品的哪个稀度所显示的信号与标准品的相当。例如，若σ32 标准品在 640 倍稀度显示中等密度的信号，而样品 D 在 1280 倍稀度显示同等的密度，则可估算出样品 D 的浓度为σ32 标准品的两倍 (见图 3-4)。
来源：丁香实验
