孚尔根反应的方法和原理

相关专题

 

Feulgen反应(Feulgen reaction)是显示DNA的最典型的组织化学反应，为学者Feulgen和Rossenbeck于1924年发明，简称为Feulgen法。因对DNA的显示反应具有高度专一性，故常被用来显示细胞内DNA的分布情况。

实 验 目 的

1. 熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法

2. 对细胞的免疫 组化 研究方法有一初步的认识

实 验 原 理

自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子 中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子 , 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。其反应机制如下图所示。

2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3

实 验 用 品

一、器材 显微镜20台、立式染色缸80个、水浴锅1台。

二、材料 香柏油5瓶，擦镜纸5本，镊子5把，盖玻片20片，用carnoy"s固定液固定的肝脏和精巢切片20片。

三、试剂

1. schiff氏试剂 将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷却至50℃时过滤，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃时，加入0.5g偏重亚硫酸钠(Na2S2O3)无水亚硫酸钠(NaHSO3)，在室温冷暗处至少放置24h(有时需2~3天)，使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。在使用前加入0.5g活性碳, 摇1min, 用粗滤纸过滤，滤液应为无色;若液体颜色变为粉红色，便不能再用。

2. 亚硫酸水(洗涤剂) 用200ml普通自来水(不要用蒸馏水, 以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。

3. 1mol/L HCl(水解用) 取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成(应将盐酸缓缓加入水中)。

4. 1%亮绿(light green) 亮绿1g，溶于100ml蒸馏水中。

5. 30%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度酒精及二甲苯。

实 验 方 法

Carnoy液固定

↓

95%酒精(2次)每次20-30min

↓

100%酒精2次(30 min, 40 min)

↓

二甲苯透明

↓

石腊包埋

↓

切片贴片

↓

二甲苯I(20 min)

↓

二甲苯II(10 min)

↓

100%酒精5min

↓

95%酒精5min

↓

85%酒精5min

↓

70%酒精5min

↓

50%酒精5min

↓

30%酒精5min

↓

蒸馏水5-10min

↓

1 mol/L HCl的染色缸内(清洗一下)

↓

温浴至60℃的1 mol/L HCl溶液中水解8 min

↓

取出标本，放入室温1 mol/L HCl溶液

(注意: 这个步骤非常重要，必须用1 mol/L稀盐酸冲洗，因为它可以洗去贴在切片上的试剂的痕迹。如用蒸馏水冲洗，则试剂本身也可以水解，所释放出的碱性品红，可以使切片内一切嗜碱性物质皆染色从而引起严重的错误。若切片较厚，可延长其水解时间，而且每次均需更换洗涤剂)

↓

蒸馏水冲洗3次(使水解停止)

↓

Schiff试剂中染色40min

↓

用亚硫酸水洗3~5次(以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料)

↓

流水冲洗5 min

↓

蒸馏水洗片刻

↓

1%亮绿复染数秒钟

(注意: 复染时间切忌过长，以免染色过深，影响对DNA的观察)

↓

水洗脱水封片

实 验 结 果

细胞核 中的DNA呈鲜亮的紫红色反应，它不但反应出DNA存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色反应的深浅，来判断DNA的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为负反应;但在有些材料的细胞质中，DNA也会出现阳性反应。

作 业

1. 绘图表示Feulgen反应的染色结果, 并验交Feulgen反应的永久切片1张。

2. 总结Feulgen反应染色结果的影响因素。

思 考 题

1. Feulgen反应的实验原理是什么?

答：DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。

2. 在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片?

答：亚硫酸可与碱性品红反应生成品红亚硫酸，从而可以将用schiff剂染色时所残留的碱性品红反应掉，以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料。

[ 附 ] Feulgen方法应注意的几个问题：

1. 对照切片的制做

进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。

2. 固定剂的选择

以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。

但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。

3. 水解时间

Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱;如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。

4. Schiff试剂的作用

Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。