孚尔根反应（Feulgen Reaction）
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实验二 孚尔根反应（Feulgen Reaction）
Feulgen反应(Feulgen reaction)是显示DNA的最典型的组织化学反应，为学者Feulgen和Rossenbeck于1924年发明，简称为Feulgen法。因对DNA的显示反应具有高度专一性，故常被用来显示细胞内DNA的分布情况。
实 验 目 的
1. 熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法
2. 对细胞的免疫组化 研究方法有一初步的认识
实 验 原 理
自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子 中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。其反应机制如下图所示。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3
实 验 用 品
一、器材 显微镜20台、立式染色缸80个、水浴锅1台。
二、材料 香柏油5瓶，擦镜纸5本，镊子5把，盖玻片20片，用carnoy"s固定液固定的肝脏和精巢切片20片。
三、试剂
1. schiff氏试剂 将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷却至50℃时过滤，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃时，加入0.5g偏重亚硫酸钠(Na2S2O3)无水亚硫酸钠(NaHSO3)，在室温冷暗处至少放置24h(有时需2~3天)，使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。在使用前加入0.5g活性碳, 摇1min, 用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。
2. 亚硫酸水(洗涤剂) 用200ml普通自来水(不要用蒸馏水, 以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。
3. 1mol/L HCl(水解用) 取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成(应将盐酸缓缓加入水中)。
4. 1%亮绿(light green) 亮绿1g，溶于100ml蒸馏水中。
5. 30%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度酒精及二甲苯。
实 验 方 法
Carnoy液固定
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95%酒精（2次）每次20-30min
↓
100%酒精2次(30 min, 40 min)
↓
二甲苯透明
↓
石腊包埋
↓
切片贴片
↓
二甲苯I(20 min)
↓
二甲苯II(10 min)
↓
100%酒精5min
↓
95%酒精5min
↓
85%酒精5min
↓
70%酒精5min
↓
50%酒精5min
↓
30%酒精5min
↓
蒸馏水5-10min
↓
1 mol/L HCl的染色缸内（清洗一下）
↓
温浴至60℃的1 mol/L HCl溶液中水解8 min
↓
取出标本，放入室温1 mol/L HCl溶液
（注意: 这个步骤非常重要，必须用1 mol/L稀盐酸冲洗，因为它可以洗去贴在切片上的试剂的痕迹。如用蒸馏水冲洗，则试剂本身也可以水解，所释放出的碱性品红，可以使切片内一切嗜碱性物质皆染色从而引起严重的错误。若切片较厚，可延长其水解时间，而且每次均需更换洗涤剂）
↓
蒸馏水冲洗3次（使水解停止）
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Schiff试剂中染色40min
↓
用亚硫酸水洗3~5次(以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料)
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流水冲洗5 min
↓
蒸馏水洗片刻
↓
1%亮绿复染数秒钟
（注意: 复染时间切忌过长，以免染色过深，影响对DNA的观察）
↓
水洗脱水封片
实 验 结 果
细胞核 中的DNA呈鲜亮的紫红色反应，它不但反应出DNA存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色反应的深浅，来判断DNA的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为负反应；但在有些材料的细胞质中，DNA也会出现阳性反应。
作 业
1. 绘图表示Feulgen反应的染色结果, 并验交Feulgen反应的永久切片1张。
2. 总结Feulgen反应染色结果的影响因素。
思 考 题
1. Feulgen反应的实验原理是什么？
答：DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。
2. 在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片？
答：亚硫酸可与碱性品红反应生成品红亚硫酸，从而可以将用schiff剂染色时所残留的碱性品红反应掉，以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料。
