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稳定转染中的问题:从G418浓度确定到单克隆化鉴定

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一、筛选之前确定G418浓度:

1、由于每种细胞对G418的敏感性不同,而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同,一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物,两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3′磷酸转移酶的基因,它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染 时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大,一般筛选时汇合度不宜超过50%。

4、G418的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml,在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选,选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验:undefined106个细胞电转后,分别接种1/4000,1/1000,1/300细胞到24孔板中,48h后加药筛选,此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后,观察1/4000孔内有两三个克隆 ,按比例1/300孔内应该有几十个克隆,事实上,它们几乎全死光了,只有几个克隆。

二、加药时间和维持浓度:

1、由于基因转染 到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早;但是也不能太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大,增值较慢,时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆,一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢,G418的浓度和活性都会下降,所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。

2、加抗生素的时机,主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染 48小时后加入抗生素。挑出单克隆后就可以用维持浓度,一般是筛选浓度的1/2。

关于维持浓度,有人说细胞会出现对抗生素的抗性,应不断提高其浓度。而且,如果你要挑选到几个阳性克隆 中较高表达的克隆的话,可以调整抗生素的浓度。当然,抗性基因高表达,目的基因不一定就跟着高表达。

三、筛选时的培养液:

加药筛选约6天左右,细胞会大量死亡,孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题:

1、死亡的细胞会裂解释放出有害物质,导致那些有neo表达的阳性细胞死亡,即非选择性死亡,因此要及时换液。

2、孔中细胞数目很少,细胞之间的信号会变得很弱,也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液:假如你要转染3T3细胞,在3T3细胞汇合度达到80%的时候,换液,培养过夜之后收集培养液,通过滤器消毒,和新鲜的培养液按1:1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。

3、适当增加血清浓度。

四、筛选时出现的问题及其解决办法:

1、问题1.做hela细胞的筛选,现在已经筛选3周,在6孔板中已经长出一些细胞簇,想把它挑到96孔板中,就用2ul胰酶消化,在消化过程中,胰酶扩散,细胞已经四散开,和周围的其它细胞簇融合在一起(我的细胞簇离的很近),就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起,那样根本没有办法做下去了,该怎么办?

a、可以减少胰酶量;胰酶在加入之前要用37度温箱预热,并且PBS润洗细胞层,以减少可能残存的血清的影响;

b、加入胰酶后,稍过几秒钟就可以吸走消化液了,不用吸干净,然后放到37度温箱中继续作用1MIN,这时,消化酶可以继续作用的,又可避免胰酶扩散;

c、显微镜下观察细胞完全松散开,就可以在你感兴趣的局部加培养基,并吸走你的可隆了呀;

d、具体消化的时间,你注意摸索一下,如果在步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开,可以再重复的,直到松散开,能够被吸走为止。

我的建议:1、在100mm dish中挑克隆,细胞分的稀一点。2、把细胞全部消化下来,在96孔板中逐步稀释获得单克隆。

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