封闭剂在细胞免疫荧光中的应用
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I、步骤:
一、固定:
PBS 5min×3次 振荡洗涤制作好的细胞爬片。
固定液覆盖细胞,RT 静置15min。
PBS 5min×3次 振荡洗涤。
二、通透化:
通透液覆盖细胞,RT 静置30min。
PBS 5min×3次 振荡洗涤。
三、封闭:
封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育:
一抗以合适浓度稀释PBS ,覆盖标本表面。
4℃孵育过夜,第二天37℃复温1h。
PBS 5min×3次 振荡洗涤。
五、二抗孵育:
FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS,覆盖标本表面。
37℃避光孵育<60min。
PBS 5min×3次 避光 振荡洗涤。
六、染核:
新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面,RT避光静置<10min。
PBS 5min×3次 避光 振荡洗涤。
七、封片:
在干净的载玻片上滴一滴封片剂,将爬片的细胞面扣在封片剂上。
八、镜检,4℃避光保存。
II、注:
1、细胞密度要合适,状态较好。
2、从孵育二抗开始要避光(关闭室内日光灯即可)。
3、完成后最好及时镜检,照相;分别用不同波长激发荧光,在Photoshop软件下合成一张图。
III、试剂配制:
1、固定液:4%多聚甲醛/PBS:
4g多聚甲醛,50~80mlPBS,加热至60℃,持续搅拌至完全溶解,(通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮),定容100ml,RT保存。
2、通透液:0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS
3、封闭液:正常山羊血清稀释于PBS;或商品化封闭液成品。
4、Hoechst:Hoechst33258即可。
5、封片剂:50%(v/v)甘油/PBS。