Northern杂交实验指导之三：DNA片断亚克隆

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A. 载体 选择

为了获得能够在体外转录RNA探针的DNA模板，其克隆载体 必须带有可供选择的特异转录启动子，同时，为了获得理想的Northern杂交试验结果，载体选择带有两种不同类型而方向相反启动子的载体，以便在RNA探针制备时同时得到两条链的转录探针。

常用的这类载体 有：pGEM-3/pGEM-4 ( 2.87kb, SP6/T7 ).

pGEM-3Z ( 2.74kb, T7/SP6 ).

PGEM-3Zf(-) (3.2kb, T7/SP6 ).

Bluescript M13- (2.96kb, T7/T3 ).

按照试验的经济有效原则，本试验选用 Bluescript M13-。

B. 目的DNA序列与载体 连接

从所建立的cDNA文库中挑选出带有目的DNA片断的克隆，扩增后提取质粒，采用限制性内切酶处理或采用PCR特异扩增的方法分离出目的DNA片断;采用标准质粒提取方法提取载体 质粒(见黄健试验)。然后按下列程序进行连接。

试剂及其制备

T4 DNA连接酶

连接缓冲液(可直接购买或配制)，10X 缓冲液配方为：

0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.8

0.1 mol/L MgCl2

50mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)

ATP 5mmol/L ( 如果直接购买商品缓冲液，有的已加在缓冲液中，但有些需单独加入)。

BSA 0.25mg/L

PEG (3500~8000均可，在缓冲液中加入2%~3% 的PEG可提高平端连接效率)。

无菌蒸馏水(SDW)

试验程序

1. 建立以下反应体系(终体积20μl)：

4μl 质粒 ( 50μg/μl)

6μl 目的DNA ( 100μg/μl)

2μl 10X 连接缓冲液

2μl DNA 连接酶

6μl 无菌蒸馏水

2. 反应管置于15℃条件下保温反应24小时，65℃加热10min.终止反应。

3.取5～10μl连接反应物用微型凝胶电泳检测连接效果，其余反应物于-20℃保存备用。

注意事项

1.保证连接反应中目的DNA与质粒载体的浓度比例在3∶1，因为高浓度的DNA有利于片断与载体的连接，低浓度的DNA则会增加载体自连。

2.DNA连接酶对温度敏感，在15℃以上会迅速失活，因此，连接反应的温度控制必须严格。

3.为了保证RNA探针的质量，模板DNA片断的完整性和纯度十分重要，在DNA制备时要严格控制。

C.感受态细胞制备(CaCl2法)

试剂及其配制

LB培养基(200ml)：2g胰蛋白冻、1g酵母浸膏、2g NaCl，溶解后调整pH至7～8，定溶到200ml混匀，分装成50ml/瓶后灭菌4℃保存。

CaCl2 0.1mol/L，4℃保存。

E. coli菌株：JM105或TG1。

试验程序

1.将单菌落菌株接种于5ml LB培养基中，在37℃条件下振荡培养过夜。

2.取0.5ml过夜培养的菌液接种于50ml LB培养基中，在37℃条件下振荡培养约3小时，用分光光度计检测OD600=0.3～0.4时，取出培养瓶置于冰上完全冷却。

3.将菌液转入离心管中，在4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。

4.将沉淀悬浮于预冷的25ml 0.1mol CaCl2中，在冰上放置30min.后，于4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。

5.沉淀重悬于2ml 预冷0.1mol CaCl2溶液中，菌液直接用于转化。或加入1.6ml 80%甘油，按每管200μl分装于2ml的冻存管中，于液氮中速冻后-70℃保存备用。

D. 质粒DNA转化

试剂及其配制

LB培养基(同C)。

氨苄青霉素：用无菌蒸馏水配制成50mg/ml的贮存液。

含氨苄青霉素(AP)的LB平板：每升LB培养基中加入15g琼脂，溶化后高压灭菌，待稍凉后再加入氨苄青霉素至终浓度为50~100μg/ml。在超净工作台上用9cm灭菌培养皿铺板。

IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)：取2g溶于8ml双蒸水中，定容至10ml，过滤灭菌后-20℃保存。

X – Gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)：贮存液浓度为20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中，-20℃黑暗保存。

试验程序

1.取制备分装好的感受态细胞，置于冰上5min.，加入连接产物10μl，轻轻混匀后置于冰上30min.。

2.然后置于42℃水浴中热击细胞50s.，再置于冰上2min.。

3.向各管中加入200μl在37℃下预热的LB培养基，37℃下振荡培养1小时。

4.与此同时，将LB平板置于37℃下片刻，每板加入44μl IPTG/X-Gal (4μl IPTG和40μl X-Gal )均匀涂布于平板表面放置约10min.使其吸附渗透。

5.将步骤3中培养的菌液涂布在制好的平板上，吹干后(在超净工作台中放置片刻)置于37℃下培养过夜。含有插入片断的菌落为白色。

E. 转化质粒的快速检测

试剂及其配制

煮沸缓冲液：蔗糖 8%

Triton X-100 1.5%

EDTA(pH 8.0) 50mmol/L

Tris-HCl(pH 8.0) 10mmol/L

LB培养基(同C)

氨苄青霉素(AP)(同D)

试验程序

1.选取白色单菌落，接种到3ml含AP的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜。

2.将培养物等分成2份按菌落编号，每一菌落编号切勿出错。一份于4℃下保存备用，每一菌落编号切勿出错。另一份转入Eppendorf中，7000rmp离心2min.，弃去上清液，吸干残留液体。

3.将沉淀菌体细胞悬浮于350μl煮沸缓冲液中，加入25μl溶菌酶后，涡旋混合。

4.将管置于100℃沸水中煮40s.，取出立即在12000rmp条件下离心15min.。

5.取10μl上清液，加入溴酚蓝染料后，在0.8%琼脂糖胶上电泳。

6.在紫外灯下根据分子量检测插入片断的完整性。

如果不能确定转化片断的大小，则要进一步杂交、测序分析。选取经检测含有完整目的DNA片断的菌落，转接于2ml TB培养基(每升16g胰化蛋白冻/10g酵母提取物/5g氯化钠)中，37℃下振荡培养过夜，取850μl菌液加入到一2ml的冻存管中，再加入150μl 50%的甘油，混匀后置于液氮中快速冷冻，再置于-70℃条件下保存。