SDS-PAGE检测外源蛋白的表达实验操作步骤

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[实验原理]

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS—PAGE)是蛋白分析中最经常使用的一种方法。它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。

pGLO是将绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆在阿拉伯糖启动子之后的一种表达载体 。携带有pGLO的大肠杆菌在含有相应诱导物和抗菌素的条件下培养，可以表达GFP，这比不加诱导物的同样的大肠杆菌在SDS—PAGE凝胶上要多出一条明显的条带。表达的蛋白也可用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，紫光灯下可以看到诱导后的样品在凝胶上有绿色荧光条带出现。还可以通过免疫印迹染色(Western—blotting)的方法，用GFP的抗体检测表达的外源蛋白。

[仪器、材料和试剂]

(一)仪器

1.垂直板电泳槽 及配套的玻璃板，梳子

2.电泳仪

3.干式恒温培养器

4.微波炉

(二)材料

1. pGLO表达质粒 转化的大肠杆菌的培养物：用阿拉伯糖诱导的和没有加阿拉伯糖诱导的

(三)试剂

1.1.5mo1/L Tris-HCl pH 8.8 (已加SDS )

2.0.5mo1/L Tris-HCl pH 6.8 (已加SDS)

3.10%SDS

4.30%Acr/Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放。

5.10%Ap (-20℃存放)

6.2x样品缓冲液

0.5mo1/L Tris-HCl pH6.8 2mL

甘油 2mL

20%SDS 2mL

0.1%溴酚蓝 0.5mL

2—?—巯基乙醇 l.0mL

双蒸水 2.5mL

7.5x电极缓冲液

Tris 7.5g

G1y 36 g

SDS 2.5g

双蒸水溶解，定容至500mL，使用时稀释5倍使用

8.染色液：0.2g考马斯亮蓝R250 + 84mL 95%乙醇 + 20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用。

9.脱色液： 酒精：冰醋酸：水=7.5：7.5：85

[实验步骤]

1.装配做胶用的玻璃板"三明治"：做1.0mm厚的胶。选择两侧的玻璃夹条为1mm的玻璃板，将其夹条面朝上平放在桌面上，把灰色的U形硅胶夹条在上面摆好，然后把带两个“耳朵”的凹玻璃放在上面，使U形硅胶夹条平整、服帖地夹在两块玻璃板之间。小心地把这玻璃板“三明治”放到“提篮架子”上，用塑料的“楔子”夹紧，注意底部的U形硅胶夹条在夹紧的过程中依然保持平整、服帖。在玻璃板“三明治”的夹缝加满蒸馏水，检验是否漏，如果漏水必须重装。

2.配制浓度为12%的分离胶 (凝胶浓度应根据被分离蛋白的分子量进行选择)，配方如下：

双蒸水 3.3 mL

1.5mo1/L Tris-HCl (pH 8.8) 2.5 mL

Acr/Big(30%) 4.0 mL

10% SDS 100 μL

TEMED 10 μL

10%AP 100 μL

总体积 10 mL (刚好灌制两块胶)

混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水(在胶面上加蒸馏水称水封，目的是保持胶面平整，并防止胶与空气接触，影响胶的聚合)，室温放置，等胶自然凝聚后(此时在胶面与水封之间可见清晰的界限)，将水封倾去。这时可以开始配制4%的浓缩胶，配方如下：

双蒸水 1.8 mL

0.5mo1/L Tris-HCl pH 6.8 0.75mL

Acr/Bis (30%) 0.4 mL

10% SDS 30 μL

TEMED 5μL

10%Ap 30μL

总体积 3.0 mL (够做两块板的浓缩胶)

混匀后加入到"三明治"玻璃板的夹缝中，然后在把1mm的梳子插进浓缩胶中，注意在梳子和浓缩胶之间不要留有气泡。如果发现有较大的气泡，一定要想法去掉(可以插拔梳子或指弹气泡处的玻璃等)，否则会影响电泳结果。待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。如果发现拔出梳子后形成的加样孔之间的间隔发生扭曲，用注射器的针头小心加以整理，使之齐整。

3.细菌培养物SDS-PAGE样品的制作：同时做L-阿拉伯糖诱导的和未加L-阿拉伯糖的两个大肠杆菌样。取细菌培养物1.5mL加到1.5mL小离心管中，12000r/m离心3分钟，去上清。在离心沉淀中加约等体积的蒸馏水，用枪头小心地吹打，使细菌充分悬浮，直到没有明显的小团块，然后加入等体积的2×样品缓冲液，在100℃沸水浴(或干式培养器)中保温5min。此时如用枪头吸取样品，会发现非常粘稠，呈鼻涕状，这是因为有样品中含有大量DNA的结果。要用胰岛素注射器将样品从极细的针头中打出，反复多次才能将DNA分子打断，使样品变得不再粘稠为止。将样品14000r/m离心5分钟，使不溶物沉淀下来，小心吸取上清加样。电泳样品的处理直接关系到电泳结果的好坏，一定要认真做样，否则跑不出好胶来。

4.琼脂封底：做好胶后，把玻璃板“三明治”从架子中取出，将两玻璃板之间的硅胶夹条去掉。去掉夹条后在凝胶的底部会留下一空隙，此空隙要用2%融化的琼脂填满，否则在玻璃板浸到电极缓冲液后空隙中的空气将很难彻底排除掉，电泳时会明显影响导电，严重时会使整个电泳失败。琼脂封底时注意不要产生气泡。

5.电泳槽组装：封底后将玻璃板“三明治”凹玻璃面向内重新装到“提篮架子”上，固定好后，将整个部件放到电泳槽的外壳中，然后加电极缓冲液。加液时要使内外槽中的液面基本等高，内槽液的液面要高出玻璃板“三明治”的凹玻璃至少5mm，以保证能够导电，且电场均匀。

6.加样：按事先设计好的顺序与加样量依次加样。在样品的浓度未知的情况下，同一样品可加一梯度，即每一泳道的加样量依次减半。这样，在做第二次电泳时可以其作为参考，正确加样。蛋白分子量标准可以加在靠中间的加样孔中，也可加在离边的第2道处(最靠边的一道样品往往会明显跑斜)。

7.电泳：将电泳槽的盖子盖上，把电泳槽的两个电极接到电泳仪上(注意电极不要接错)，然后接通电源。先将电压调到80V，当样品进入分离胶时，调节电压使恒定在150V。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，关掉电源，停止电泳。将玻璃板从电泳槽中取出，小心地用旧的电话卡撬开两玻璃板，暴露出胶面。将浓缩胶部分去掉不要，分离胶放到塑料盒中染色。

8.染色和脱色：凝胶在考马斯亮蓝染色液中染色20分钟(摇床上缓慢振荡)，然后倾去染色液(染色液回收，可反复用数十次)，用自来水洗几下，去掉凝胶上和塑料盒中的染色残液，加脱色液脱色(摇床上缓慢振荡)，1小时后换一次脱色液，振荡脱色过夜。彻底脱色后的凝胶蛋白条带清晰，背景透明干净。这时可以将凝胶拍照或用扫描仪进行扫描，作为永久记录。