完美双向电泳操作步骤

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(一)第一向等电聚焦

1.从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT，不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管)，置室温溶解。

2.在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。

3.从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。

4.从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cm pH 4-7)，室温中放置10分钟。

5.沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。

6.当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

7.分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。

8.在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

9.对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。

10.聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳 ，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

(二)第二向SDS-PAGE电泳

1.配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面 ，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。

2.待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。

3.从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。

4.配制胶条平衡缓冲液I。

5.在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

6.将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

7.配制胶条平衡缓冲液II。

8.第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

9.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺 凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶慷宰抛约骸?br>

10.将琼脂 糖封胶液进行加热溶解。

11.将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。

12.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。

13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。

14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

15.用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。

16.放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。

18.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流(5mA/gel/17cm)或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流(或电压)(20-30mA/gel/17cm)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

19.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号(戴手套，防止污染胶面)。

20.进行染色。