二苯胺法测定DNA含量的实验方法
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【实验目的】
掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法
【实验原理】
DNA分子 中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ-酮基戊酸，后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物，其反应如下图。
蓝色化合物在595nm处有最大吸收，且DNA在40µg ~400µg范围内时，吸光度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
<center> </center>【实验材料】
1.实验器材
恒温水浴,721分光光度计 。
2.实验试剂
(1)DNA标准溶液：准确称取小牛胸腺DNA10mg，以0.1mol/L NaOH溶液溶解，转移至50ml容量瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液稀释至刻度。浓度为200µg/m1;
(2) DNA样品液：用上述实验方法提取的DNA样品
(3)二苯胺试剂：使用前称取1g结晶二苯胺，溶于100m1分析纯冰醋酸中，加60%过氯酸10m1混匀。临用前加入1m1 1.6%乙醛溶液。此溶剂应为无色。
【实验操作】
1.标准曲线的绘制
取干燥试管6支，编号，按表所示加入试剂。
|
试剂 |
管号 |
|||||
|
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
|
DNA标准溶液，ml |
0.0 |
0.4 |
0.8 |
1.2 |
1.6 |
2.0 |
|
蒸馏水，ml |
2.0 |
1.6 |
1.2 |
0.8 |
0.4 |
0 |
|
二苯胺试剂，ml |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
|
A595 |
|
|
|
|
|
|
加完毕，混匀，于60℃恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处测定吸光度，以零号管作对照，绘制标准曲线。
2.样品测定
取试管3支，两支为样品管，—支为对照管。对照管操作与标准曲线零号管相同。向每支样品管中加入2m1样品液及4ml二苯胺试剂，60℃保温1h，冷却后于595nm测定吸光度，以对照管调零点。根据测得的吸光度，从标准曲线上查出相应吸光度的DNA含量。
【实验结果讨论】
1.该反应灵敏度较低，但方法简便，目前仍广泛使用。
2.其他糖及糖的衍生物、芳香醛、羟基醛和蛋白质等，对此反应由干扰，测定前应尽量除去。
