从农杆菌提取质粒向大肠杆菌DH10B电转化方法

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准备工作：

①制做选择平板LB+25 mg/l Kan。

②核对好要转化的质粒 DNA，在15 ml Falcon tube 和cuvette（电转化用的石英样品槽，两面磨光，两面磨砂）标好质粒名称。将Falcon tube、cuvette、质粒DNA、SOC培养基按顺序对应置于冰上预冷或解冻。转化前将大肠杆菌（45 µl aliquot of E. coli DH10B Cell s）置于冰上解冻（约3-5 min）。

一、将冰桶移置超净工作台上，取200-1000 µl、20-100 µl、0.5-10 µl 移液器 （Fubbouoette）到超净工作台上。先用0.5-10 µl移液器取0.5-2 µl质粒DNA到大肠杆菌细胞内，再用调节到50 µl 的（20-100 µl移液器）上下吹吸数次。在冰上放置2 min。

二、用调节到50 µl 的（20-100 µl移液器 ）将质粒DNA和大肠杆菌细胞混合液转移到电转化石英样品槽底凹槽的中央，在桌面上轻击数次使之分散。在冰上放置1-2 min。

三、先用纸将样品槽擦拭一下，移到2.5 kV电脉冲发生器上，同时用1000 µl移液器 吸好SOC培养基，约4.5-5 sec后鸣叫声停后，立即加入样品槽内（吹吸一次或不吹吸）。

四、将细胞悬浮液从样品槽中取出并加入15 ml Falcon tube，在37℃，200/min振荡培养1 h。在样品槽中加满自来水，以便清洗。

五、在此期间，可制做选择平板LB+25 mg/l Kan。

六、将培养后的转化大肠杆菌悬液在超净工作台上全部倒入1.5 ml微量离心管，13000 rpm离心30 s（或到达13000 rpm后离心15 s）。用1000 µl移液器取出大部分的上清，再用50 µl移液器全部弃掉剩余的上清，之后吸取100 µl LB培养基重新悬浮沉淀，上下吹吸数次到均匀。

七、对三角铁焚烧灭菌，标记选择平板，取30 µl LB培养基加入平板中心，再取重新悬浮后的转化大肠杆菌30 µl加入平板中心。待三角铁冷却后，在平板上研磨，至无可见液体为止。注意三角铁一定要冷却，或先在无菌液的平板上研磨加速冷却。

八、将选择平板在37℃下培养，1天后观察转化效果。

九、清洗电转化样品槽。先用自来水吸瓶冲洗十多次，之后加入酒精，放置1 h，之后用蒸馏水冲洗数次，甩干后，水平放置在滤纸上晾干。