分离纯化DNA片段中的污染物方法和原理

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一、 实验目的

1、 了解分离纯化DNA片段中的污染物方法和原理

二、 实验原理

首先利用低熔点琼脂 糖凝胶电泳 DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理(在高盐、低pH值情况下吸附DNA;低盐、高pH值情况下释放DNA。离心柱上含有Resin合成树脂，具有吸附DNA的功能)，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机 ，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。

三、 仪器与试剂

实验仪器

1、琼脂糖凝胶电泳系统

2、紫外观察分析仪

3、离心机

4、单面刀片

5、恒温水浴锅

试剂

1、 DNA回收试剂盒

溶胶液：6 M NaClO 4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC(pH 5.2)溴酚红少许

洗液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA ，pH 8.0) 70%乙醇

存储液：TE buffer (10 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0).

2、50×TAE(洗液：50 mM Tris-Hcl，0.1 mM EDTA，pH 8.0) 70%乙醇

)

3、ddH2O(重蒸水，蒸馏两次的水)

四、实验步骤

1)在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖.放入1.5ml离心管中。

(切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。所以为了减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。)

(紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。)

2)按每100mg琼脂糖加入300—600μl溶胶液的比例加入溶胶液(本实验加500ul)，置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠倒混匀一次促溶。

(利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以下几个原因：胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解;胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收;电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合 DNA，如pH太高，应作适当调整;漂洗液中未加入无水乙醇。)

3)将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体.再将吸附柱放入同一个收集管中。

4)在吸附柱中加入500ul漂洗液，室温静置1分钟后， 12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

5)再在吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

6) 12000rpm 室温空离心1分钟。

(可以改用去离子水 洗脱。但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH 值，以增加洗脱得率。

洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液)

7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后， 12000rpm 室温离心1分钟(为提高回收效率可再洗脱一次)，将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。

8)琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。

(不可以使用更小洗脱体积(小于说明书提供的最小洗脱体积)进行洗脱以提高浓度，因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。

电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。

琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好;含目的片段的凝胶再空气中放置过久， 使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃;制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。)

五、注意事项：

§ 切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛;

§ 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。

§ 胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。

§ 把洗脱液加热，使用时有利于提高洗脱液效率。

& 提高胶回收量的办法：

1) 增加电泳时的上样量。

2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。

3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要了，不然影响回收率。

4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。

5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多于750ul。

6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性(电荷)和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul(PH 5.0，3mol/L的 NaAC);为了使DNA分子 更好 的拦截在膜上，可以添加30%异丙醇在加热溶解胶后的液体里。

7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟(大约需10分钟)，以使乙醇充分挥发。

8)最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱(不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱);洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在 膜上的DNA。

9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。

10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。