若干miRNA检测技术小结

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解读miRNA （MicroRNA）

1 Northern 杂交

Northern 杂交是检测mirna表达的一种简便而可靠方法，不仅用于检测mirna在组织细胞中的表达水平，而且结合rna marker，可经凝胶电泳检测mirna的分子大小。

1993年始，Northern 杂交应用于mirna表达谱研究，也是首个用于半定量检测mirna的实验技术，通过将已知浓度梯度的寡核苷酸参照物与待测样品进行平行杂交，实现对mirna的半定量检测。而后，northern杂交成为检测细胞中mirna表达的常规研究方法之一。 northern杂交最大的缺点是对样品的需求量较高，需要微克级样品才能避免假阴性，有时样品量达到40 μg才会出现明显杂交信号。

2 原位杂交

原位杂交 分为细胞和组织内原位杂交，该技术检测mirna表达，可更直观的展示出mirna的时空表达模式。80年代后期可在福尔马林固定、石蜡包埋的组织中进行原位杂交，近年来扩展到细胞及亚细胞水平进行mirna的检测。该技术不仅可以检测不同细胞系单个细胞中的mirna表达，还可在不经分类和分离的情况下，比较不同细胞系中mirna的表达水平。

3 基因芯片

基因芯片技术可以高通量的检测基因表达谱。最初的mirna基因芯片，是将反义dna探针点在尼龙膜上，然后以5′端放射性标记的mirna样品杂交，再经放射自显影获得信号。

尽管基因芯片技术敏感度有了很大提高，且可用于多个mirna同时检测，但仍有不足：基因芯片的制作和检测需要昂贵的仪器设备;结果是半定量的，重复性较差;不能同时优化所有待测mirna的杂交环境，因而不能区分高度类似的mirna，等等。锁定的核苷酸修饰探针(locked nucleic acidmodified probe)在基因芯片技术的应用，可能会进一步较精确地区分高同源性mirna的表达差异。

4 反转录聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，rtpcr)

4.1 半定量rtpcr

rtpcr作为半定量或定量检测mirna表达的常用实验方法，在研究mirna表达的过程中不断得到改进。半定量rtpcr是常用的一种简洁、快速、特异的相对定量的rna检测技术，只能测定mirna的相对含量，后来有研究对半定量rtpcr加以改进:(1)rna加尾rtpcr：rna加尾rtpcr是在传统rtpcr的基础上发展而来，可用于半定量或定量检测mirna的表达,结果与northern杂交一致。该技术有以下优点：可在较短时间内获得结果;高通量，可同时检测多种mirna的表达;与northern杂交相比，仅需少量rna，且不用放射性同位素标记;可同时检测到成熟mirna及其对应的premirna;操作过程简单。该技术检测mirna表达时需注意以下问题：有的mirna和其他mirna具有同源区域，它们的引物序列就是mirna基因序列5′端的一部分，因而要确保引物3′端的不同;退火温度是保证高度特异扩增的关键因素，有研究提出，较高的退火温度(60 ℃～61 ℃)可提高反应的特异性;与用总rna相比，使用从低分子量rna中富集的mirna可提高该技术的敏感性。(2)引物延伸rtpcr：引物延伸rtpcr既可检测成熟的mirna，也可检测单个mirna和sirna。后经改进把引物延伸用于实时rtpcr 定量检测mirna的表达，包括以下步骤：用加尾的特异引物把mirna反转录为cdna，在cdna的一端引入1个结合位点延长长度;实时定量pcr检测。

4.2 实时定量rtpcr

实时定量rtpcr可用于检测mirna在肿瘤中的表达水平。

steploop实时定量rtpcr是一项高特异度、敏感度的检测mirna表达的实验技术，包括设计具有茎环(stemloop)结构的反转录引物和用mirna荧光标记的特异分子探针进行实时pcr 2个关键步骤。该技术有以下优点：高度特异性，特异的steploop 反转录引物和探针确保反应不受其前体及基因组dna污染等因素的干扰，对序列高度同源的mirna也可精确区分;超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级;样品消耗少，仅需1～10 ng的总rna;适用范围广，总rna 、细胞裂解物以及纯化的rna都可用于mirna的定量检测，也可用于其他小分子rna的检测，如sirna。但是该技术需要较昂贵的实验材料及仪器。