聚合酶综述

互联网2013-08-27

1789

相关专题: 重组DNA技术工具酶

聚合酶-简介

1957年，美国科学家阿瑟·科恩伯格(Arthur Kornberg)首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶，这种酶被称为DNA聚合酶I(DNA polymerase I，简称：Pol I)。1970年，德国科学家罗尔夫·克尼佩尔斯(Rolf Knippers)发现DNA聚合酶II(Pol II)。随后，DNA聚合酶III(Pol III)被发现。原核生物中主要的DNA聚合酶及负责染色体复制的是Pol III。

聚合酶-分类

可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶;(2)依赖RNA的DNA聚合酶;(3)依赖DNA的RNA聚合酶;(4)依赖RNA的RNA聚合酶。前两者是DNA聚合酶，它使DNA复制链按模板顺序延长。如在原核生物中仅就大肠杆菌中已被发现的就有三种(分别简称为P01Ⅰ，P01Ⅱ和P01Ⅲ等);DNA聚合酶只能在有引物的基础上，即在DNA或RNA引物的3′-OH延伸，这DNA的合成方向记为5′→3′。换言之DNA聚合酶催化反应除底物(αNTP)外，还需要Mg2 、模板DNA和引物，迄今细胞内尚无发现可从单体起始DNA的合成。同样，上述(3)和(4)是催化RNA生物合成反应中最主要的RNA合成酶，它们以四种三磷酸核糖核苷(NTP)为底物，并需有DNA模板以及Mn2 及Mg2 的存在下，在前一个核苷酸3′-OH与下一个核苷酸的5′-P聚合形成3′，5′-磷酸二酯键，其新生链的方向也是5′→3′。RNA聚合酶也大量存在于原核和真核生物的细胞中。如大肠杆菌RNA聚合酶分子量4.8×105，由5条多肽链组成，分别命名为α，α，β，β′，和γ，全酶可用α2ββ′λ表示。真核生物RNA聚合酶分子大于5×105，由10～12个大小不等亚基组成。聚合酶除作为自然界生命活动中不可缺少的组分外，在实验室中大多用作生命科学研究的工具酶类之一。

聚合酶-特性

聚合作用:

在引物RNA'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3'-OH与5'-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3'-5'外切酶活性位点所识别并切除之。

聚合酶结构图

3'5'外切酶活性──校对作用:

这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被3'→5'外切酶活性所降解。如果提高反应体系的温度可以促进这种作用，这表明温度升高使DNA生长链3'末端与模板发生分离的机会更多，因而降解作用加强。当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。由此推论，3'→5'外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被3'→5'外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。在某些T4噬菌体突变株中DNA复制的真实性降低，而易发生突变，从此突变株分离得到的聚合酶的3'→5'外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突变能力的T4突变株中的聚合酶的3'→5'外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。可见，3'→5'外切酶活性对DNA复制真实性的维持是十分重要的。

聚合酶分子反应示意图

5'3'外切酶活性──切除修复作用:

5'→3'外切酶活性就是从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部份(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5'末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。

焦磷酸解作用:

DNApolⅠ的这种活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n XPPi←(dNMP)n-x X(dNPPP)→DNA

焦磷酸交换作用:

催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。反应式为32P32Pi dNPPP←dNP32P32P PPi→DNA

最后两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向前推进，即没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。这种反应叫缺口平移(Nicktranslation)。当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNApoIⅠ能从切口开始合成新的NDA链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为α-32P-dNTP，则重新合成的新链即为带有同位素标记的DNA分子，可以用作探针进行分子杂交实验。

尽管DNApolⅠ是第一个被鉴定的DNA聚合酶，但它不是在肠杆菌中DNA复制的主要聚合酶。主要证据如下:[1]纯化的DNApolⅠ催化dNTP掺入的速率为667碱基/分，而体内DNA合成速率要比此高二倍数量级;[2]大肠杆菌的一个突变株中，此酶的活力正常，但染色体DNA复制不正常;[3]而在另一些突变株中，DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%，但是DNA复制却正常，而且此突变株增加了对紫外线、烷化剂等突变因素的敏感性。这表明该酶与DNA复制关系不大，而在DNA修复中起着重要的作用。

一些特定的DNA聚合酶对于化学修饰性核苷分子显示出惊人的耐受性，从而为高度功能化的核酸分子的有效合成提供了令人激动的新机遇。

聚合酶-研究成果

新兴纳米技术的一个诱人之处就是它可以识别核酸是否可作为一种用途多样的有效实验平台，以应用于建造那些更为复杂的生物医学工具。有多种特定的功能基团能以共价键的形式联接到核苷上，而核苷又依次通过几种化学反应组装成链状物。一方面这是一种耗费劳动的过程，但在另一方面，一些科学家现在正通过此种过程来检验自然产生的酶类是否可以用作一种更为有效的替代物。德国波恩大学的MichaelFamulok就是这样的研究者。他的研究小组已经发表了几篇文章介绍这种方法的可行性。最近，他们加大研究力度，使用七种不同的细菌性DNA聚合酶，系统检测了包含有酸性、碱性和亲脂性之类的不同功能基团的多种核苷分子整合到寡核苷酸链的情况。一些酶很难对这些异化性底物产生作用，但Pwo和Vent这两种聚合酶则与众不同，它们能有效地将所有能检测到的核苷变异分子进行有效整合。在随后的实验中，Famulok的研究小组描述了那些可能影响整合效率的模板顺序决定簇;以这两个包含所有四种核苷类型变异体的寡核苷酸聚合酶为例证，介绍了这些酶的高效合成;同时还介绍了为生产功能相近产物而对一种修饰性模板成功进行的PCR扩增。

聚合酶分子反应示意图

这些聚合酶的适应性对于将来开发诸如寡聚核苷酸适配子之类的生化工程产品具有重要的意义。Famulok解释说：“这种新增化学特性也许能使寡聚核苷酸适配子获得更多类似于蛋白质的活动特征，而同时并没有丢失它所拥有的类似核酸方面的优点。这对你希望使用寡聚核苷酸适配子作为诊断剂或药物来说是非常有用的。”同时，他也希望将这种方法应用于有关高次DNA结构的复杂工程问题，例如，利用那些通过蛋白质交互作用的类似方式能进行自组装的电荷分布改变特征，构建修饰性DNA分子。虽然这些工作还需要进一步完善，但同样的原理也可以应用到RNA分子的功能化方面，为RNA小分子的良性管理提供新的可能。Famulok建议，“你可以将被束缚的碱基以生化酶的时髦方式引入到RNA小分子中，接着试图通过一个光脉冲或者其它类似的东西，激活这个RNA小分子。” Famulok最希望他的研究小组能为那些具有创新想法的研究者提供一种有价值的参考。他说：“如果人们想利用功能化的高密度DNA做些事情的话，虽然这些新思路我个人目前因为愚钝还无法想象的话，但他们能在我们的论文中找到重要启发，来帮助他们实现梦想。”

聚合酶-现状

《自然》杂志近日在线发表由中国科学院生物物理研究所研究员刘迎芳领导的研究组和南开大学饶子和院士领导的南开大学—清华大学—生物物理所联合研究组，共同完成的一项有关禽流感病毒聚合酶结构的研究，、揭示出流感病毒聚合酶关键部分PA亚基与PB1多肽复合体的精细三维结构，填补了禽流感病毒聚合酶结构领域研究的空白。这一结构的解析，为研究禽流感病毒的复制机制，以及设计抗流感病毒的药物提供了真实可用的模型。据介绍，流感病毒基因组含有8个RNA片段，已知可以编码11种病毒蛋白质。其中，由PA、PB1和PB2这3个亚基组成的聚合酶复合体是负责病毒基因组RNA复制以及病毒mRNA转录的关键组分，同时由于它的高度保守性、低突变率，成为抗流感病毒药物设计的重要靶点。多年来的研究认为，PB1是病毒RNA聚合酶的催化亚基，负责病毒RNA的复制以及转录;PB2是负责以一种称为“Snatch”的方式夺取宿主mRNA的CAP帽子结构用于病毒mRNA转录;而PA亚基不但参与病毒复制过程，而且还参与病毒RNA转录、内切核酸酶活性、具有蛋白酶活性以及参与病毒粒子组装等多种病毒活动过程，因而在整个聚合酶复合体的研究中显得格外重要。研究人员利用全新的思路，解析了PA与PB1氨基端多肽蛋白复合体的2.9埃分辨率晶体结构。该结构清晰显示了PA与PB1多肽相互作用模式，发现该作用位点的氨基酸残基在流感病毒中高度保守，这为广谱抗流感(包括人流感和禽流感)药物研究提供了一个理想的靶蛋白。同时，根据该复合体结构以及已知的一些蛋白突变体研究结果，推测了PA亚基在聚合酶中的作用，为进一步研究提供了分子基础。