如何用S1核酸酶对RNA作图

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用S1核酸酶对RNA作图

三种不同的核酸酶——S1核酸酶、RNA酶、外切核酸酶Ⅶ被用来进行RNA定量，确定内含子位置，以及用来鉴定在克隆 的DNA模板上的mRNA 5′端和3′端的位置。当检测RNA被杂交到DNA模板上时，用核酸酶S1进行保护试验的分析;当检测RNA被杂交到来自DNA模板的RNA上时用RNA酶。外切核酸酶Ⅶ有更专一的用途——对短的内含子作图并解决S1核酸酶保护试验中出现的异常情况。

这三种酶的使用方法是Berk和Sharp(1977)提出的经典S1核酸酶保护试验技术的改良。含有目的mRNA的RNA样品与互补的DNA或RNA探针在利于形成杂合体的条件下温育。在反应的末期，一种酶用来降解未杂合的单链RNA和DNA。剩下的DNA-RNA或RNA-RNA杂合体用凝胶电泳分离，接着用自显影或Southern杂交来观察。当探针的摩尔数在杂交反应中过量时，信号的强度和样品中的目的mRNA的浓度成正比。用过量探针与一系列定量靶序列杂交作出标准曲线，从而准确估算样品浓度。S1核酸酶保护试验的最初模式中一个主要的问题是用双链DNA作为探针。为防止探针DNA在杂交一步重新结合，理想的情况是建立有利于形成RNA-DNA杂合体远甚于形成DNA-DNA杂合体的反应条件，但并不总是可行。因为DNA-RNA杂合体比DNA-DNA杂合体略微稳定，复性条件一般是含80%甲酰胺、温度高于双链DNA熔点的计算值。然而，在这种条件下，杂交速度降低约10倍，而且DNA-RNA杂体产物的稳定性也不确定。使用单链探针则可以解决这些问题。复性可以在正常的杂交条件下进行，因为没有互补的单链和靶RNA竞争探针。但是当Berk和Sharp进行研究时，还没有可靠的方式去除其互补部分的单链DNA。链分离凝胶电泳是那时惟一可行的方式，但它始终是一种技巧 性很强、难于掌握的技术。只有70%的DNA片段可以得到分离，而且即使在相当成功的条件下，样品中也不可避免的污染互补DNA单链。直到20世纪80年代后期，通过制造有高度特异活性的标记单链DNA或RNA探针才解决了这一问题。

S1核酸酶保护试验中使用的探针 通常是由双链DNA两条链分离得到的，已知极性且特异性高。或者更普遍地，从头合成与双链DNA模板的一条链互补的RNA或与单链模板互补的DNA。

链分离的探针通过同时或依次使用两种Ⅱ型限制性内切核酸酶预处理，产生在5′端和3′端各有一段突出的合适大小的DNA片段(通常100~500个核苷酸)。因此该片段的一条链最多可以比另一条链长8个核苷酸。在变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳 已足够分离这种差异的两条链。在电泳前或电泳后，目的单链的5′端被去磷酸化并从[γ-32P]得到标记的磷酸基团，从而在体外被标记，T4噬菌体多核苷酸激酶催化这一反应。

从头合成探针法用来体外产生末端标记或均匀标记的DNA探针。末端标记的探针通过将寡核苷酸引物的5′端磷酸化而得到。均匀标记的探针通过放射标记的核苷酸引入正在合成的DNA单链得到。在两种情况下，通过一种可识别新合成的双链DNA上特异位点的限制性酶酶切，分离新合成的DNA链和模板。接下来可以用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离放射性标记的探针和线性化的单链DNA。

当一种引物浓度是另一种的20~200倍时，PCR反应严重偏听偏向于合成只和DNA其中一条链作用的放射性标记探针。当PCR反应刚开始的几个循环里，双链DNA以普遍的指数形式合成。然而，当一种引物的浓度受限时，反应以算术速度产生单链DNA。到反应结束时，DNA某一条链的浓度比另一条多3~5倍。

通过双链DNA模板和仅一种引物的热循环反应合成完全只含DNA一条链的放射性标记的探针。经过40个循环，双链模板DNA(20 μg)产生约200 μg的单链探针。探针的长度可以通过在模板DNA探针结全位点的下游选取酶切位点加以限定。

通过转录连在噬菌体启动子上的线形双链DNA模板，可以产生均匀标记的RNA探针，即核糖核酸探针。通过在重组质粒克隆的DAN序列中或其下游选取酶切位点酶切可以得到DNA模板，也可用PCR扩增模板。线形化的模板在[γ-32P]NTP存在的条件下由合适的噬菌体来源的依赖DNA的RNA聚合酶转录，产生长度为从模板DNA片段启动子的起始位点到其终点的标记的RNA。启动子和DNA序列按照一定的方向排列，从而使得到的核糖核酸探针与待分析的mRNA是反义(互补)。严谨的但并非必须的后续工作是用变性琼脂糖凝胶电泳纯化RNA探针。纯化可以用微型凝胶模子里配制的5%聚丙烯酰胺凝胶-8 mol/l尿素体系以及微型蛋白凝胶装置中简易快速的执行。

即使使用单链探针，用S1核酸酶分析真核RNA结构还是会有假象。例如，DNA:RNA杂合双链中微小的不配对就会对S1核酸酶有抗性。相反地，富含rU:dA序列的完美配对的杂合双链区容易受到酶切。一条单链DNA分子如果同时和两条不同的RNA分子杂交，则可以不被核酸酶作用。最后一点，S1核酸酶不能有效地切割与RNA突出环相对的一段DNA。大多数这些问题可以用改变S1核酸酶浓度、采用不同酶切浓度、使用不同的核酸酶(如绿豆核酸酶)、使用几种核酸酶组合(如RNase H和S1核酸酶)来解决。但是注意的是，用S1核酸酶作用于两种核酸并不一定能反映出差异，而不被消化的两条核酸也不一定相同。用S1核酸酶绘制mRNA 5′端和3′端图谱，很得要的一点是要用独立的技术如引物延伸来加以验证。

在许多作图实验中，绿豆核酸酶可以替代S1核酸酶。当和DNA探针一起使用时，完成单链区完全酶切所需的绿豆核酸酶远少于S1核酸酶。例如，酶切对应于人低密度脂蛋白受体的过量的单链DNA探针需要S1核酸酶达到1000 单位/ ml可完成完全酶切，而绿豆核酸酶只需要10 单位/ ml就可达到相同的结果。绿豆核酸酶的生个缺点是在单位碱基上的用量比S1核酸酶多20倍。在下述实验方案中，绿豆核酸酶可以在第22步替代S1核酸酶。绿豆核酸酶消化作用的缓冲液：10 mmol/l醋酸钠(pH 4.6)-50 mmol/l NaCl-1 mmol/l ZnCl-1 mmol/l β-硫基乙醇-0.001%(V/V)Triton X-100。