材料与仪器
[γ-32P」ATP 合适的寡核苷酸 DNA 模板l 10XdNTP 混合物 KLenow 片段 合适的限 制性内切核酸酶 X 射线胶片 洗脱缓冲液 tRNA 石蜡油 S1 核酸酶
10X 激酶缓冲液 PNK 10X 复性缓冲液 6% 聚丙烯酰胺 8mol L 尿素溶液 (溶于 0.5XTBE) 及甲酰胺染料 乙酸钠 4X 杂交缓冲液 去离子甲酰胺 S1 缓冲液 S1 终止缓冲液 异丙醇
垂直电泳装置 水浴 杂交管 杂交炉
10X 激酶缓冲液 PNK 10X 复性缓冲液 6% 聚丙烯酰胺 8mol L 尿素溶液 (溶于 0.5XTBE) 及甲酰胺染料 乙酸钠 4X 杂交缓冲液 去离子甲酰胺 S1 缓冲液 S1 终止缓冲液 异丙醇
垂直电泳装置 水浴 杂交管 杂交炉
步骤
一、材料与设备
1) 垂直电泳装置
2) 水浴
3) 杂交管
4) 杂交炉
5) 用于从单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针的试剂。①10X 激酶缓冲液:400 mmol/LTris-HCl(pH7.8),100 mmol/LMgCL2，1OOmmol/L 疏基乙醇，250 ug/ml 牛血淸白蛋白储存于 -20℃ ②[γ-32P」ATP(比活度 3000Ci/mmol)③合适的寡核苷酸：溶于蒸馏水，浓度为 l0 pmol/L, 存于 —20℃ ④ PNK（polynuclemidekinase）：多核甘酸激梅，浓度为 10 U/ul, 存于 20°C.⑤10X 复性缓冲液：100mmol/LTris-HCl (ph7.5).，l00 mmol/L MgCl2，500 mnnol/L NaCl，10O mmol/L DTT⑥DNA 模板：l mg/ml ⑦10XdNTP 混合物：5 mmol/LdATP、dCTP、dGTP、dTTP,.⑧KLenow 片段：大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的大片段，浓度为 lOU/ul 存于 -20℃,⑨合适的限制性内切核酸酶。⑩6% 聚丙烯酰胺/8mol/L 尿素溶液 (溶于 0.5XTBE) 及甲酰胺染料。⑪X 射线胶片：需具有合适的灵敏度.⑫洗脱缓冲液：50 mmol/L TrisHCl(PH7.5)，0.5 mmol/LEDTA。⑬3mol/L 乙酸钠 (pH7.4)⑭tRNA:10 mg/ml 储存液，储存于-20°C
6) 杂交和 S1 分析。①4X 杂交缓冲液：1.6 mmol/LNaCl，40 mmol/LPIPES(pH6.4)。②去离子甲酰胺。③石蜡油。④S1 缓冲液：300 mmol/LNaCl30 mmol/L 乙酸钠 (pH4.5);4.5 mmol/L 乙酸锌，⑤S1 核酸酶：浓度为 10U/ul，储存于-20℃。⑥S1 终止缓冲液：2.5mol/L 乙酸铵,50 mmol/LEDTA⑦异丙醇
二、操作方法
(一）单链 DNA 探针的制备
1. 由单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针
1) 寡核苷酸探针的标记：在 0.5 ml 离心管屮加入下列组分:
寡桉苷酸 1ul
[γ-32P]ATP 10ul
l0x 激酶缓冲液 2ul
dH2O 6ul
多核苷酸激酶 1ul
将上述组分混合，于 37℃ 保温 45 min 以标记寡核苷酸探针，最后于 95℃ 保温 2 min 以灭活多核苷酸激酶。
2) 加入 2ul 笋链 DNA 模板，4ul10X 复性缓冲液，14ulH2O，依次在 65℃10 min，55℃ lOmin，37℃ lOmin 保温
3) 加入 4ul NTP 混合物，lul Klenow 片段，室温作用 10 min 后于 65℃15 min, 灭活Klenow 片段
4) 加入适量的 NaCl 或通过稀释校正混合物的浓度，加人 20U 限制性内切核酸酶，37℃ 保温 60 min
5) 加入 2ul tRNA 储存液 A1 倍体积的 3mol/L 乙酸钠，3 倍体积的乙醇 5 置于干冰中 10 min，12000 g 离心 15 min 以沉淀样品
6) 加入 20ul 甲酰胺染料重悬沉淀，于 95℃ 加热上取样于 6% 聚丙烯酰胺/尿素凝胶 h, 至溴酚蓝达到凝胶底端时结束电泳。
7) 凝胶用 X 射线感光片曝光 5 min，确定单链 DNA 片段的位置。切下相应的条带，置于 500ul 洗脱缓冲液中过夜。
8) 加入 50ul 乙酸钠 T20ugtRNA,lml 乙醇。置于一 20℃ 中 2 h,12000 g 离心 20 min
9) 将沉淀作放射活性计数后重悬干甲酰胺中按 lO5 cmp/ul), 储茌于一 20°C。此探针剂吋用于杂交和 S1 分析
2. 从双链 DNA 模板制备单链 DNA 探针
除下列步骤外, 其余步骤均 1「由单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针'
1）先用所选的限制性内切核酸酶切割双链质粒（20ug)，沉淀重悬于水中，浓度为 lmg/ml
2) 复性步骤 1「由单链 DNA 模板制备笮链 DNA 探针」屮第 2) 步需快速进行。加热灭活多核苷酸激酶后加入 2〜5ug 酶切质粒、、4ul10X 复性缓冲液、14ul 水。95°C 保温 5 min，立即置于冰水屮，然后按步骤由单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针」中第 3) 步进行。
3) 省去限制性酶切，即 1「由单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针」中第 4) 步。
(二）杂交和 S1 核酸酶分析
1) 于 0.5 mlEppendorf 管中加入下列组分：
探针（共 10000cpm) 10ul
4X 杂交缓冲液 5ul
RNA(总 poly(A)+RNA 或离体合成的） 5ul
石蜡油 (以防止蒸发） 20ul
混勻于 37℃ 保温 4〜16 h。
2) 加 200 ul S1 缓冲液 (含 S1 核酸酶 100U)，充分混匀，置于 37°C 中 5〜30 min。加入 50 ul S1 终止缓冲液终止反应，并加入 40 ug tRNA，300ul 异丙醇. 置于干冰屮 15 min,12000 g 离心 15 min
3) 用 80% 乙醇洗沉淀物，晾干后重悬于 3ul 甲酰胺染料中，95℃ 加热 5 min，上样于6% 聚丙烯酰胺/尿素凝胶，电泳至溴酚蓝到达凝胶底端，将凝胶曝光 8〜48 h
1) 垂直电泳装置
2) 水浴
3) 杂交管
4) 杂交炉
5) 用于从单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针的试剂。①10X 激酶缓冲液:400 mmol/LTris-HCl(pH7.8),100 mmol/LMgCL2，1OOmmol/L 疏基乙醇，250 ug/ml 牛血淸白蛋白储存于 -20℃ ②[γ-32P」ATP(比活度 3000Ci/mmol)③合适的寡核苷酸：溶于蒸馏水，浓度为 l0 pmol/L, 存于 —20℃ ④ PNK（polynuclemidekinase）：多核甘酸激梅，浓度为 10 U/ul, 存于 20°C.⑤10X 复性缓冲液：100mmol/LTris-HCl (ph7.5).，l00 mmol/L MgCl2，500 mnnol/L NaCl，10O mmol/L DTT⑥DNA 模板：l mg/ml ⑦10XdNTP 混合物：5 mmol/LdATP、dCTP、dGTP、dTTP,.⑧KLenow 片段：大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的大片段，浓度为 lOU/ul 存于 -20℃,⑨合适的限制性内切核酸酶。⑩6% 聚丙烯酰胺/8mol/L 尿素溶液 (溶于 0.5XTBE) 及甲酰胺染料。⑪X 射线胶片：需具有合适的灵敏度.⑫洗脱缓冲液：50 mmol/L TrisHCl(PH7.5)，0.5 mmol/LEDTA。⑬3mol/L 乙酸钠 (pH7.4)⑭tRNA:10 mg/ml 储存液，储存于-20°C
6) 杂交和 S1 分析。①4X 杂交缓冲液：1.6 mmol/LNaCl，40 mmol/LPIPES(pH6.4)。②去离子甲酰胺。③石蜡油。④S1 缓冲液：300 mmol/LNaCl30 mmol/L 乙酸钠 (pH4.5);4.5 mmol/L 乙酸锌，⑤S1 核酸酶：浓度为 10U/ul，储存于-20℃。⑥S1 终止缓冲液：2.5mol/L 乙酸铵,50 mmol/LEDTA⑦异丙醇
二、操作方法
(一）单链 DNA 探针的制备
1. 由单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针
1) 寡核苷酸探针的标记：在 0.5 ml 离心管屮加入下列组分:
寡桉苷酸 1ul
[γ-32P]ATP 10ul
l0x 激酶缓冲液 2ul
dH2O 6ul
多核苷酸激酶 1ul
将上述组分混合，于 37℃ 保温 45 min 以标记寡核苷酸探针，最后于 95℃ 保温 2 min 以灭活多核苷酸激酶。
2) 加入 2ul 笋链 DNA 模板，4ul10X 复性缓冲液，14ulH2O，依次在 65℃10 min，55℃ lOmin，37℃ lOmin 保温
3) 加入 4ul NTP 混合物，lul Klenow 片段，室温作用 10 min 后于 65℃15 min, 灭活Klenow 片段
4) 加入适量的 NaCl 或通过稀释校正混合物的浓度，加人 20U 限制性内切核酸酶，37℃ 保温 60 min
5) 加入 2ul tRNA 储存液 A1 倍体积的 3mol/L 乙酸钠，3 倍体积的乙醇 5 置于干冰中 10 min，12000 g 离心 15 min 以沉淀样品
6) 加入 20ul 甲酰胺染料重悬沉淀，于 95℃ 加热上取样于 6% 聚丙烯酰胺/尿素凝胶 h, 至溴酚蓝达到凝胶底端时结束电泳。
7) 凝胶用 X 射线感光片曝光 5 min，确定单链 DNA 片段的位置。切下相应的条带，置于 500ul 洗脱缓冲液中过夜。
8) 加入 50ul 乙酸钠 T20ugtRNA,lml 乙醇。置于一 20℃ 中 2 h,12000 g 离心 20 min
9) 将沉淀作放射活性计数后重悬干甲酰胺中按 lO5 cmp/ul), 储茌于一 20°C。此探针剂吋用于杂交和 S1 分析
2. 从双链 DNA 模板制备单链 DNA 探针
除下列步骤外, 其余步骤均 1「由单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针'
1）先用所选的限制性内切核酸酶切割双链质粒（20ug)，沉淀重悬于水中，浓度为 lmg/ml
2) 复性步骤 1「由单链 DNA 模板制备笮链 DNA 探针」屮第 2) 步需快速进行。加热灭活多核苷酸激酶后加入 2〜5ug 酶切质粒、、4ul10X 复性缓冲液、14ul 水。95°C 保温 5 min，立即置于冰水屮，然后按步骤由单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针」中第 3) 步进行。
3) 省去限制性酶切，即 1「由单链 DNA 模板制备单链 DNA 探针」中第 4) 步。
(二）杂交和 S1 核酸酶分析
1) 于 0.5 mlEppendorf 管中加入下列组分：
探针（共 10000cpm) 10ul
4X 杂交缓冲液 5ul
RNA(总 poly(A)+RNA 或离体合成的） 5ul
石蜡油 (以防止蒸发） 20ul
混勻于 37℃ 保温 4〜16 h。
2) 加 200 ul S1 缓冲液 (含 S1 核酸酶 100U)，充分混匀，置于 37°C 中 5〜30 min。加入 50 ul S1 终止缓冲液终止反应，并加入 40 ug tRNA，300ul 异丙醇. 置于干冰屮 15 min,12000 g 离心 15 min
3) 用 80% 乙醇洗沉淀物，晾干后重悬于 3ul 甲酰胺染料中，95℃ 加热 5 min，上样于6% 聚丙烯酰胺/尿素凝胶，电泳至溴酚蓝到达凝胶底端，将凝胶曝光 8〜48 h
注意事项
1) 寡核苷酸长度为 20〜25 个核甘酸，并与所分析的 DNA 互补。
2) 单链或双链 DNA 模板均按标准方法制备，与双链 DNA 模板制备探针相比，用单链 DNA 模板制备探针的优点主要是探针的得率更高，用单链模板制备时比活可达 1X106-1.5×106cpm
3) 为提高片段的冋收率，限制性内切核酸酶应于寡核苷酸杂交处 3＇端 200〜600 个核酸的位置上进行酶切，更长的片段就难于从丙烯酰胺胶中回收。如果所用的限制性内切核酸酶切割 DNA 模板上的不止一个位点，只要它们位于探针序列以外，就不会有妨碍。
4) 所分析的 RMA 种类不同，杂交时间亦不同. 若用细胞质总 RNA 或 poly(A)+RNA 样品，成于 37°C 至少杂交 12 h; 而用体外转录的 RNA 则杂交 2〜4 h.
5) 分析离体转录的 RNA 时，S1 核酸酶作用时间町先选择 15 min、30 min、60 min 三种，这样可以确定将所有的单链核酸，包栝游离的探针，均被完全消化所需的条件，分析细胞质总 RNA 或 Poly(AVRNA 时，S1 核酸酶的最佳消化时间为 30 min，往往比消化离体转录的 RNA 所需的时间（15 min) 要长一些。
2) 单链或双链 DNA 模板均按标准方法制备，与双链 DNA 模板制备探针相比，用单链 DNA 模板制备探针的优点主要是探针的得率更高，用单链模板制备时比活可达 1X106-1.5×106cpm
3) 为提高片段的冋收率，限制性内切核酸酶应于寡核苷酸杂交处 3＇端 200〜600 个核酸的位置上进行酶切，更长的片段就难于从丙烯酰胺胶中回收。如果所用的限制性内切核酸酶切割 DNA 模板上的不止一个位点，只要它们位于探针序列以外，就不会有妨碍。
4) 所分析的 RMA 种类不同，杂交时间亦不同. 若用细胞质总 RNA 或 poly(A)+RNA 样品，成于 37°C 至少杂交 12 h; 而用体外转录的 RNA 则杂交 2〜4 h.
5) 分析离体转录的 RNA 时，S1 核酸酶作用时间町先选择 15 min、30 min、60 min 三种，这样可以确定将所有的单链核酸，包栝游离的探针，均被完全消化所需的条件，分析细胞质总 RNA 或 Poly(AVRNA 时，S1 核酸酶的最佳消化时间为 30 min，往往比消化离体转录的 RNA 所需的时间（15 min) 要长一些。
来源：丁香实验
