DNase I的特点及使用方法

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DNase I可以将DNA链消化成寡脱氧核苷酸，因此常常用于RNA提取 过程中消化掉提取核酸中所残留的DNA成分而得到高纯度的RNA产物。

DNase I，即Deoxyribonuclease I，中文名称为脱氧核糖核酸酶 I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。

DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点;二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸 突出的粘末端。

特点：不含RNase(RNase free)，可以用于各种RNA样品的处理。提供了用于DNase I失活所需的EDTA 。

用途：制备不含DNA的RNA样品;RT-PCR 反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染;体外T7, T3, SP6等RNA Polymerases催化的RNA转录后去除DNA模板; DNase I footprinting研究DNA-蛋白质相互作用;缺口平移(nick translatioin);产生DNA随机片断文库;细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照。

来源：从牛胰腺纯化得到。

分子量：约32kDa(单体)。

活性定义：37℃10分钟内，将能够完全降解1μg pBR322质粒DNA所需的酶量定义为1个活性单位。

活性检测条件：40mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgSO4，1mM CaCl2，1μg of pBR322 DNA。

纯度：不含其它DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。

酶储存溶液：50mM Tris-acetate(pH7.5)，10mM CaCl2，50%(v/v)glycerol。

Reaction Buffer(10X)：100mM Tris-HCl(pH7.5 at 25℃)，25mM MgCl2，1mM CaCl2。

失活或抑制：加入EDTA至终浓度为2.5mM后，65℃加热10分钟可使DNase I失活。酚氯仿抽提也可以使DNase I失活。金属离子螯合剂，达到毫摩尔/升浓度的锌离子，0.1%的SDS，DTT、巯基乙醇等还原剂，50-100mM以上盐浓度均对DNase I有显著抑制作用。

使用说明：

1. RT-PCR反应前RNA样品中DNA的去除：

a. DNA模板限制性核酸内切酶作用后线性化。酚/氯仿和氯仿/异丙醇提取DNA，用乙醇沉淀后，溶于适量

的无菌去离子水中。

b. 向一无RNA酶的EP管中依次加入下列试剂：

RNA	1μg
Reaction Buffer (10X)	1μl
补充经DEPC处理的去离子水	至9μl
DNase I(1U/μl)	1μl

注意：如需处理较大量的RNA样品，可以按照比例放大上述反应体系。如果能在上述反应体系中加入

适量Ribonuclease inhibitor以防止RNA降解则更佳。

c. 37℃孵育30分钟。

d. 向上述反应体系中加入1μl 25mM EDTA，65℃孵育10分钟以失活DNase I。注意：在没有鏊合剂如

EDTA等存在情况下加热，RNA可被水解。

e. 上述加热处理过的RNA样品即可直接用于处理好的RNA可用作RT-PCR反应的模板。

2. 体外RNA反转录后模板DNA的去除：

a. 在每含有0.5μg模板DNA的反转录反应体系中加入1U DNase I。注意：在某些情况下，模板DNA完全消

化所需的DNase I的量需通过实验进行摸索。

b. 37℃ 孵育15分钟。

c. 酚/氯仿抽提失活DNase I。

3. 缺口平移进行DNA标记：

a. 参考下表格设置反应体系：

Reaction Buffer (10X) for DNA Polymerase I	2.5μl
3 dNTP Mixture (1mM each, without the labeled dNTP) *	1.25μl
[α-32 P]-dNTP, ～110TBq/mmol (3000Ci/mmol)	1.85-3.7MBq (50-100μCi)
DNase I (freshly diluted to 0.002U/μl~undefined~K~Hp~M~2~1~0~0~0~0~K~Htd~M~2~1~0~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~0~0~Kp~M~2~1~0~0~0~0~0~01~8amp~Jmu~Jl~K~Hp~M~2~1~0~0~0~0~K~Htd~M~2~1~0~0~0~K~Htr~M~2~1~0~0~0~Ktr~M~2~1~0~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~0~0~Kp~M~2~1~0~0~0~0~0~0DNA_Polymerase_I~E_E.coli~K~Hp~M~2~1~0~0~0~0~K~Htd~M~2~1~0~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~0~0~Kp~M~2~1~0~0~0~0~0~00._5~F1.5~8amp~Jmu~Jl_~A5~F15U~B~K~Hp~M~2~1~0~0~0~0~K~Htd~M~2~1~0~0~0~K~Htr~M~2~1~0~0~0~Ktr~M~2~1~0~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~0~0~Kp~M~2~1~0~0~0~0~0~0Template_DNA~K~Hp~M~2~1~0~0~0~0~K~Htd~M~2~1~0~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~0~0~Kp~M~2~1~0~0~0~0~0~00.25~8amp~Jmu~Jg~K~Hp~M~2~1~0~0~0~0~K~Htd~M~2~1~0~0~0~K~Htr~M~2~1~0~0~0~Ktr~M~2~1~0~0~0~0~Ktd~M~2~1~0~0~0~0~0~Kp~M~2~1~0~0~0~0~0~0补充无核酸酶去离子水	至25μl

~undefined 3 dNTP Mixture(1mM each, without the labeled dNTP)：分别取除已经标记的dNTP外的3种dNTP

(100mM)各1μl加入到97μl 的无核酸酶的去离子水中混匀即可。例如标记的为dATP，则需混合

dTTP、dCTP和dGTP三种dNTP至每种的最终浓度为1mM。配制好的dNTP可存放于-20℃以备后续使

用。

~undefined_DNase_I可以用1X Reaction Buffer for DNA Polymerase I进行稀释。

Reaction Buffer(10X)for DNA Polymerase I：500mM Tris-HCl(pH7.5 at 25℃)，100mM MgCl2，

10mM DTT。

b. 立即15℃孵育15～60分钟。

c. 上述反应体系中加入1μl of 0.5M EDTA(pH 8.0)终止反应。

d. 从中取出少量例如1μl检测标记效率。通常标记效率至少可以达到108cpm/μg DNA。

e. 可用Sephadex G-50或Bio-Gel P-60去除[α-32P]-dNTP，以纯化获得标记的DNA。

4. DNase I也可用于其他途经，但使用方法均与上述讲述类似，可以参考上述用途进行。