6XHis 标签的特点以及它的使用方法

6xHis 标签，也称为多组氨酸标签， His6 标签或 hexa 组氨酸标签, 是一种在转染的细胞中目标蛋白的 C 端或 N 端上由至少 6 个组氨酸残基链接上所组成的氨基酸序列。这种标签通常在重组蛋白的纯化中使用，这是因为组氨酸残基的序列可以在特定的缓冲液条件下结合到几种类型固定的离子上（比如镍，钴和铜）从而达到容易检测和纯化 His 标签蛋白的目的。

由于它的相对小的分子量，低的免疫原性，亲水性和在去污剂和其他添加剂存在的情况下的易变性, 因此在天然和变性的条件下，多组氨酸标签是被公认为最广泛使用的亲和标签用于一系列的蛋白纯化目的。

除此之外，它可以检测和纯化重组蛋白而无需使用蛋白特异性的抗体或探针，同时抗 His 标签抗体的存在用于 His 标签蛋白的检测中使 6xHis 标签更加的普遍和受欢迎。

亲和纯化蛋白

在大肠杆菌和其他原核系统中表达的多组氨酸标签重组蛋白通常使用固定的金属离子亲和色谱来纯化或称为 IMAC. 在这个过程中，支撑物 (通常是珠状琼脂糖凝胶或磁珠颗粒) 用合适的耦合试剂来进行衍生，比如氨三乙酸 nitrilotriacetic acid (NTA) 或亚氨乙酸 iminodiacetic acid (IDA).

这些螯合的基团会固定所需要的二价金属离子 (比如镍，铜，钴和锌)，从而这些金属离子最后负责结合和分离混合液蛋白中的目标分子。在选择使用哪个配基上，你需要考虑 IMAC 树脂的结合能力主要取决于被纯化蛋白的性质和在纯化过程中所使用的金属离子。

注意：需要更加深入完整的了解如何选择最好的螯合试剂来达到我的目的，请参考我们之前发的一篇文章，- -「对于 NTA 和 IDA 配基你需要知道哪些」。

镍，钴，铜是进行纯化 His 标签蛋白首选的被广泛使用的离子，由于他们在水溶液中对于组氨酸和半胱氨酸良好的亲和性。在这三个离子中，镍是最广泛使用的金属离子，它呈现出最高的亲和性和选择性对于 His 标签蛋白. 然而，它也会非特异性的结合包含组氨酸群的内源蛋白。

从另一个侧面讲，钴提供最特异性的结合和组氨酸标签因此当纯度是首要选择时钴是二价阳离子的首选。

铜离子和镍钴离子相比和 His 标签蛋白的结合非常强劲，但是它的特异性在三种离子中是最弱的。由于这个原因，当纯度不是最主要的目的时铜离子 IMAC 被使用。

IMAC 方法

在制备样品时，细胞被捕获和裂解通过酶法或机械条件。因为多组氨酸标签在生理 PH 值和离子强度下很好的结合到 IMAC 树脂上。结合在几乎中性缓冲液的条件下完成。大部分科研人员使用包含 10-25 mM 咪唑的 TBS 溶液作为结合/漂洗缓冲液来防止带有组氨酸残基内源蛋白的非特异性的结合. 被捕获的组氨酸标签蛋白的洗脱和回复通常使用增加的咪唑浓度 (至少 200 mM) 来实现，低 PH 值或一个过量的强螯合剂比如 EDTA.

你可以从各种起始缓冲液中来纯化样品，因为高浓度的盐和某些变性剂是兼容的。然后，请记住还原剂，氧化剂和螯合剂比如 EDTA 通常和 IMAC 亲和树脂是不兼容的。

其他用于 His 标签蛋白的应用

除了纯化多组氨酸标签重组蛋白之外，6xHis 标签也可以用于如下应用。

ELISA 或免疫印迹检测： 你可以使用镍螯合的辣根过氧化物酶来进行基于 HRP 组氨酸标签蛋白的检测而无需使用抗体。同时，抗 6xHis 的抗体是高度灵敏和特异性的对于那些含有组氨酸标签的蛋白.

蛋白相互作用 pull-down： 镍琼脂糖树脂可以用于纯化，鉴定和检测组氨酸标签蛋白的相互作用。

微孔板包被： 镍或铜包被的微孔板可以从初始样本或半纯化的样品中使融合蛋白进行包被，从而进行基于各种微孔板和报告基因的检测.

凝胶染色：几种免疫分析方法利用多组氨酸标签通过抗多组氨酸标签抗体或通过 SDS-PAGE 来检测靶蛋白。

荧光标签：荧光 6 组氨酸标签也被科研人员开发用于蛋白迁移和转移。