生物检材中的DNA提取方法
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一、Chelex-100法提取生物检材中的DNA
Chelex 100能有效除去非核酸有机物,主要用于提取全血或血痕、精液或精斑、混合斑、毛发、培养细胞等。但因生物样本来源不同其操作方法有所差异,以下分别介绍:
(一)全血
(1)取3~10μl全血加到0.5ml离心管中,加人500μl纯水,剧烈振荡,室温下放置15分钟。
(2)13,000rpm离心3分钟,去上清,收集沉淀。(必要时可用蒸馏水反复洗沉淀物,直至无色或血色素很少)。
(3)沉淀中加入200μl 5% Chelex-100溶液(5% Chelex-100为悬浊液,使用前要充分振摇,使Chelex-100颗粒悬浮),在振荡器上反复振荡,放入56℃保温30分钟以上。
(4)取出后振荡,100℃保温8分钟,振荡后,13,000rpm离心3分钟,上清用于PCR 扩增,或放4℃保存备用。
(二)血斑
(1)剪取约0.5cm2的血斑,加到0.5ml的离心管中,加入500μl纯水,剧烈振荡,室温放置15分钟。13,000离心3分钟,去上清。(可用纯水反复洗至无色,载体 不需去除,始终留在离心管中。)
(2)以下步骤同全血的提取方法。
(三)混合斑
(1)取适量含有混合斑的检测,剪碎后放入5ml小烧杯中,加入3ml纯水、300μl 10% SDS及150μl 5mg/ml 的PK酶,用牙签搅拌后,放入37℃水浴6小时以上(最好过夜)。
(2)将水浴好的检材移入1.5ml离心管(检材载体 用一次性注射器挤压后去除),13,000rpm 离心3分钟,去上清,每管加1.4ml 纯水,振荡,13000rpm 离心3分钟。洗三次后,移入0.5ml离心管中,13000rpm离心3分钟,弃上清。
(3)向沉淀物的离心管中加入200μl 5%的Chelex-100(可根据检材量的多少进行调节),4μl 5mg/ml 的PK酶及8μl 1M的DTT(PK酶及DTT的终浓度分别为100μg/ml和0.039M),振荡后56℃保温过夜。次日取出振荡,100℃保温8分钟,振荡,13000rpm离心3分钟,上清用于PCR 扩增或放4℃保存备用。
(四)含有唾液斑的检材
(1)唾液斑:处理方法与血斑的处理方法相同。
(2)烟头:用镊子夹住烟头,剪刀剪下烟头外圈的纸,剪碎后放入0.5ml离心管中,加人500μl纯水,剧烈振荡,13000rpm离心3分钟,弃上清,加入100μl 5% 的Chelex-100,放入56℃保温30分钟以上。取出振荡,100℃保温8分钟,13000rpm离心3分钟,上清用于PCR 扩增或放4℃保存备用。
(3)口香糖:将口香糖剪碎后放入0.5ml离心管中,加人500μl纯水,剧烈振荡,13000rpm离心3分钟,弃上清,加入100μl 5% 的Chelex-100,放入56℃保温30分钟以上。取出振荡,100℃保温8分钟,振荡,13000rpm离心3分钟,上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。
(五)毛根
用镊子夹住毛发的根部,剪去其余部分,将毛根放入0.5ml离心管中(处理毛发时很容易遗失,应小心操作,最好在桌面上铺一张白纸。),加人纯水洗一次,然后加入30μl 5%的Chelex-100和2μl 5mg/ml 的PK酶,放入56℃保温6小时以上。取出振荡,100℃保温8分钟,振荡,13000rpm离心3分钟,上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。
(六)肌肉与脑组织
取小米粒大小的肌肉或脑组织,放入0.5ml离心管中,加人纯水洗一次,然后加入200μl 5%的Chelex-100和 5μl 5mg/ml 的PK酶,放入56℃保温3小时以上。取出振荡,100℃保温8分钟,振荡,13000rpm离心3分钟,上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。
二、盐析法
(一)试剂
TE缓冲液(TE Buffer)
红细胞裂解液RCLB
DSP work solution:DSP stock solution 980μl
蛋白酶K(10mg/ml) 15μl
Tween-20 5μl
(二)操作步骤
1)取100μl全血置于1.5ml EP管中。
2)加500μl TE缓冲液,充分混匀,静置5分钟。
3) 13,000 rpm离心2分钟,用无菌分液管移弃上清液。
4)加500μl TE缓冲液,重复步骤②和③一遍。
5)加红细胞裂解液(RCLB)500μl,重度步骤②和③两遍。
6)最后一次RCLB洗涤时,移去上清液,加入100μl DSP工作液,充分混匀,直至沉积块破碎。
7)56℃干热器孵育2小时。
8)混匀,95℃干热器孵育10分钟。
9)加35μl高氯酸钠,混匀后13,000rmp离心5分钟,小心吸取上清液移至另一Ep管中。
10)加2.5倍体积冷无水乙醇,沉淀DNA,12,000rmp离心8分钟,弃上清液。
11)加入1ml 70%乙醇洗涤DNA,10,000rmp离心5分钟,弃上清液。
置超净工作台内自然干燥后,加入100μl ddH2O,置4℃保存待用。