生物检材中的DNA提取

一、Chelex-100法提取生物检材中的DNA

Chelex 100能有效除去非核酸有机物，主要用于提取全血或血痕、精液或精斑、混合斑、毛发、培养细胞等。但因生物样本来源不同其操作方法有所差异，以下分别介绍:

（一）全血

(1)取3～10μl全血加到0.5ml离心管中，加人500μl纯水，剧烈振荡，室温下放置15分钟。

(2)13,000rpm离心3分钟，去上清，收集沉淀。（必要时可用蒸馏水反复洗沉淀物，直至无色或血色素很少）。

(3)沉淀中加入200μl 5％ Chelex-100溶液（5％Chelex-100为悬浊液，使用前要充分振摇，使Chelex-100颗粒悬浮），在振荡器上反复振荡，放入56℃保温30分钟以上。

(4)取出后振荡，100℃保温8分钟，振荡后，13,000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增，或放4℃保存备用。

（二）血斑

(1)剪取约0.5cm2的血斑，加到0.5ml的离心管中，加入500μl纯水，剧烈振荡，室温放置15分钟。13,000离心3分钟，去上清。（可用纯水反复洗至无色，载体不需去除，始终留在离心管中。）

(2)以下步骤同全血的提取方法。

（三）混合斑

(1)取适量含有混合斑的检测，剪碎后放入5ml小烧杯中，加入3ml纯水、300μl 10% SDS及150μl 5mg/ml 的PK酶，用牙签搅拌后，放入37℃水浴6小时以上（最好过夜）。

(2)将水浴好的检材移入1.5ml离心管（检材载体用一次性注射器挤压后去除），13,000rpm 离心3分钟，去上清，每管加1.4ml 纯水，振荡，13000rpm 离心3分钟。洗三次后，移入0.5ml离心管中，13000rpm离心3分钟，弃上清。

(3)向沉淀物的离心管中加入200μl 5％的Chelex-100（可根据检材量的多少进行调节），4μl 5mg/ml 的PK酶及8μl 1M的DTT（PK酶及DTT的终浓度分别为100μg/ml和0.039M），振荡后56℃保温过夜。次日取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。

（四）含有唾液斑的检材

(1)唾液斑：处理方法与血斑的处理方法相同。

(2)烟头：用镊子夹住烟头，剪刀剪下烟头外圈的纸，剪碎后放入0.5ml离心管中，加人500μl纯水，剧烈振荡，13000rpm离心3分钟，弃上清，加入100μl 5％ 的Chelex-100，放入56℃保温30分钟以上。取出振荡，100℃保温8分钟，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。

(3)口香糖：将口香糖剪碎后放入0.5ml离心管中，加人500μl纯水，剧烈振荡，13000rpm离心3分钟，弃上清，加入100μl 5％ 的Chelex-100，放入56℃保温30分钟以上。取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。

（五）毛根

用镊子夹住毛发的根部，剪去其余部分，将毛根放入0.5ml离心管中（处理毛发时很容易遗失，应小心操作，最好在桌面上铺一张白纸。），加人纯水洗一次，然后加入30μl 5％的Chelex-100和2μl 5mg/ml 的PK酶，放入56℃保温6小时以上。取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。

（六）肌肉与脑组织

取小米粒大小的肌肉或脑组织，放入0.5ml离心管中，加人纯水洗一次，然后加入200μl 5％的Chelex-100和 5μl 5mg/ml 的PK酶，放入56℃保温3小时以上。取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13000rpm离心3分钟，上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。

二、盐析法

（一）试剂

TE缓冲液(TE Buffer)

红细胞裂解液RCLB

DSP work solution：DSP stock solution 980μl

蛋白酶K(10mg/ml) 15μl

Tween-20 5μl

（二）操作步骤

1)取100μl全血置于1.5ml EP管中。

2)加500μl TE缓冲液，充分混匀，静置5分钟。

3) 13，000 rpm离心2分钟，用无菌分液管移弃上清液。

4)加500μl TE缓冲液，重复步骤②和③一遍。

5)加红细胞裂解液(RCLB)500μl，重度步骤②和③两遍。

6)最后一次RCLB洗涤时，移去上清液，加入100μl DSP工作液，充分混匀，直至沉积块破碎。

7)56℃干热器孵育2小时。

8)混匀，95℃干热器孵育10分钟。

9)加35μl高氯酸钠，混匀后13，000rmp离心5分钟，小心吸取上清液移至另一Ep管中。

10)加2.5倍体积冷无水乙醇，沉淀DNA，12，000rmp离心8分钟，弃上清液。

11)加入1ml 70%乙醇洗涤DNA，10，000rmp离心5分钟，弃上清液。

置超净工作台内自然干燥后，加入100μl ddH2O，置4℃保存待用。