专家解惑：如何开展单细胞qPCR分析（二）

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如今，单细胞基因组 学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学研究不再是遥不可及。利用新兴的微流体方法和分子生物学技术，研究人员逐渐能从群体噪音中提取单细胞信号。《Genome Technology》杂志请来了一些专家，来分享他们在单细胞qPCR分析上的经验。通过一问一答的形式，希望能为您的研究带来一点启发。

专家解惑：如何开展单细胞qPCR分析（一）

Q3：在改善单细胞qPCR 实验设计上，您有哪些建议?

Mikael Kubista(TATAA生物中心)

每个细胞可以测定的标志物数量是有限的，这就让标志物的选择很关键。选择标志物的策略取决于研究目的。如果目标是研究表达通路和基因网络，那么选择标准就与目标是区分细胞类型时完全不同。一旦标准确定，可利用软件 (如GenEx)中的统计学选择工具。

Anders Ståhlberg(哥德堡大学)

单细胞基因表达谱分析通常需要多个RT-qPCR 实验。在开始单细胞实验之前，应当对细胞群体进行测定和分析。细胞群体测定将为您提供有用的信息，让您清楚应使用哪些实验条件，并对目的基因的表达水平有个大概了解。

因经费和时间限制，分析实验条件和生物学重复通常是不可行的。对于第一轮实验，我们通常测定40-100个细胞中的10个基因，避免预扩增。这一数据将为您提供细胞异质性和关键标志物表达水平的信息。之后，设计更大的实验就会比较轻松。

Finn-Arne Weltzien(挪威兽医学院)

一定要包含可靠的对照实验，以避免假阳性。在制备和开展实验时要特别小心，避免RNA降解或逆转录 条件不佳。

Weiwen Zhang(亚利桑那州立大学，现在天津大学)

总的来说，下面三个步骤的效率对一个成功的单细胞分析很重要：细胞分离、RNA分离和cDNA合成、以及单细胞qPCR的引物设计。我们发现，适合高丰度模板的引物不一定适合单细胞水平的qPCR模板。

Q4：您采取哪些步骤来减少实验误差以及噪音?

Mikael Kubista(TATAA生物中心)

建立可重复的实验步骤是非常重要的。例如，可将裂解液分成几等份，单独分析和比较，以检验裂解。利用CelluLyser，我们发现各等份之间的一致性很好，说明细胞均匀地裂解。利用加热或蒸馏水来裂解细胞通常产生异质的裂解液，导致各等份不均一。通过RNA加标可检测回收效率和重复性。我们设计了一个带有5’帽子和A尾巴的通用加标，以模拟天然的mRNA。RNA加标可添加到裂解液中，或显微注射到细胞中。逆转录也应当优化。因引物结合、目的基因和逆转录酶的不同，RT产量可相差200倍之多。此外，添加到RT预混液中的裂解液的量也必须仔细调整，以避免抑制，同时让RT产量最高。预扩增同样应该精心优化和验证。总的来说，重复性比避免偏向(bias)更关键，尽管这两个参数通常是密切相关。

Anders Ståhlberg(哥德堡大学)

所有实验步骤都必须精心优化。首先应确保您采集的细胞代表了群体，且有着良好的RNA质量。尽量减少不同实验步骤之间的稀释。这很重要，因为分子总数很少。不过，要避免加入过高浓度的去污剂、逆转录酶等，以免抑制下游实验。逆转录、预扩增和qPCR都对抑制敏感。例如，逆转录酶可能抑制预扩增和qPCR。稀释倍数取决于酶的选择和品牌。如果只分析少数基因，应避免预扩增，以免此步骤引入更多偏向。运行技术重复可能收获不大。相反，应尽可能地收集和分析更多细胞。

Finn-Arne Weltzien(挪威兽医学院)

在制备和开展实验时，必须一丝不苟。我们还用疏水物质包被玻璃移液管，以避免带电荷的核酸吸附在玻璃上，这可能导致假阳性。记住，qPCR引物必须是最高质量的，才能产生高质量的结果。

Weiwen Zhang(亚利桑那州立大学，现在天津大学)

根据我们发表的结果，技术重复之间的误差通常极小。然而，生物学重复之间的误差就难以确定，因为无完美的对照存在。为了尽量减少单细胞之间的误差，我们一般平行运行全部单细胞qPCR分析(包括RNA分离、cDNA合成和实时定量PCR)，并在一块PCR加热板中(如ABI 48孔、96孔或384孔板)。

(未完，待续)