如何选择qPCR预混液

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随着定量PCR 在不断改善，多重qPCR同样如此。多重qPCR是将几个PCR分析合在一起，同时扩增并独立检测目标，它在提高通量的同时也节省了样品。与单重qPCR相比，尽管它需要更多时间和精力，但用户得到了丰富的数据。

然而，多重qPCR 并不是单重反应的简单叠加，因为在一个反应管中，任何一个目标的扩增都能影响其他目标的扩增。让反应条件同时适合这么多个目标，这似乎不太容易，但使用qPCR预混液可能有帮助。预混液为预先优化好的混合物，通常包含缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、MgCl2及其他专利的添加剂。

一些专业人士坦言，对于多个指标，包括qPCR 效率、特异性、灵敏度、速度及耐受多个循环条件和样品类型，目前还尚未实现完美的平衡。大部分qPCR预混液能够在一些方面胜出，但很难是全部。如何选择最适合的那一个，小编下面给出了一些建议。

探针 还是染料?

当然，就多重分析而言，探针法是唯一选择。SYBR Green只适合单重反应。不过，SYBR Green的优势在于能监控qPCR 反应的质量。你能够了解反应过程中发生的所有扩增，是否存在残留污染，是否有引物二聚体等等，这是探针型分析无法给予的。

顺便提一下，大家通常认为探针法更加特异，而SYBR Green更为经济，适合筛查多个目标。然而，专家却有不同的看法。Qiagen全球高级产品经理Annette Tietze认为：“SYBR Green检测是一种经济高效的方法，主要用于未知目标的筛查。而在科学家寻找一个有趣的目标时，他们倾向于转到探针型PCR，因为他们认为这更加特异。在Qiagen，我们比较了SYBR Green和探针型检测，发现通过这两种方法，我们能实现至少相同的特异性，因此无需转变。”

我能达到几重?

提高多重分析能力无疑是受欢迎的。许多厂家提供二重分析试剂，有些提供了五重试剂。安捷伦的MassCode PCR solution甚至支持25重分析，它融合了多重PCR和LC/MS技术。首先，开展多重PCR。每个引物都带有一个标签(tag)，这样每个扩增子都有两个标签。随后纯化PCR产物，并将包含产物的96孔板置于自动上样器中，这样每个样品上样到LC/MS系统中，切除标签，并通过质谱仪检测。如果你们实验室没有质谱仪，而又想开展多重分析，那么下面的一些方案可能适合你。

罗氏应用科学部的Light Cycler 480 Probes Master Mix能成功支持4重反应，甚至达到5重。这是一种即用型的反应预混液，包含了FastStart Taq 热启动型DNA聚合酶，它能减少非特异产物的形成，从而显著改善PCR的特异性和灵敏度。

Bio-Rad的iQ Multiplex Powermix能检测最多4个目标，即使它们的表达量相差106倍，若表达量相当，则可以检测最多5个目标。若起始样品为cDNA，则线性范围可达6个数量级，若起始样品为基因组DNA，则线性范围达4个数量级。

QIAGEN也推出了多重分析试剂盒，能检测最多4个目标，如新的QuantiFast Multiplex PCR 和RT-PCR Kit，而现有的QuantiTect Multiplex Kit适合标准循环仪。据介绍，QuantiFast试剂盒适用于标准和快速的循环仪，兼容双标记的TaqMan探针，如QuantiFast Probe Assay。此外，QIAGEN还提供专门用于Rotor-Gene Q的 Rotor-Gene Multiplex PCR和RT-PCR Kit。所有这些试剂盒都是为基因表达分析设计的，能同时检测最多4个目标，用在两步法和一步法RT-qPCR中。这些试剂盒特别适合低丰度的转录本，能检测低至10个拷贝。

如何提高成功率

建立多重反应的步骤如下：1)优化引物和探针序列，2)选择标记探针的报告基因和淬灭基因，3)优化单重实验，4)验证多重实验，5)必要时，优化多重实验。在开始多重PCR前，需要记住几件事。

从简单开始 想要一步登天，那是不可能的。在多重反应之前应通过单重反应来鉴别你的目标。之后再进入多重形式，看看引物-探针组合是否起作用。如果你的引物-探针组合不太好，就别深入下去，开展3重或4重检测。建议使用商业付费软件如Beacon Designer来设计多重反应的引物和探针组合。

反应体积 另一个考虑是反应体积。有些起始材料有限或很昂贵，那么研究人员会将反应体积缩小，以节约样品。反应体积能缩到多小，而不干扰反应本身呢?大部分客户使用20 μl反应体系。有人也许会问，5 μl反应体积能获得相同的结果吗?体积少了4倍意味着试剂少了4倍。对于二重反应而言，这可能蛮有挑战性，因为那些试剂之间互相竞争，可能更快地消耗。另一个潜在的问题是热循环过程中的蒸发。

起始材料 还有一个考虑是起始材料的相对量，相似量的结果一般更好。现在的难题是可靠检测同一管中的高丰度和低丰度目标。PCR反应会优先扩增高丰度，易于扩增的目的片段，从而导致非特异产物或缺少预期产物。以高效率结合的引物利用更多的PCR反应成分，从而降低了其他PCR产物的产量。这常常导致某些DNA序列未被扩增，或缺少预期的PCR产物，最终导致假阳性或假阴性结果。

为此，QIAGEN提供了一种秘密武器，所有的多重PCR试剂盒都使用了一种特制的PCR缓冲液，它内含独特的添加剂MP因子。连同K+及其他阳离子，MP因子允许高效的引物退火和延伸，而与引物序列无关。MP因子提高了引物在DNA模板周围的局部浓度，并稳定了特异结合的引物。

Bio-Rad的qPCR预混液中也包含了专利的Sso7d融合蛋白技术，可帮助消除这个问题。Sso7d是一个小的双链DNA结合蛋白，能提高PCR聚合酶的速度、灵敏度和抑制剂耐受力，从而增强其性能。SsoFast Probes Supermix支持起始量相差一万倍的双重反应。

记住，当定量PCR走向多重，这可不是单重反应的简单叠加，我们还需要周密设计，反复优化，才能获得更好的结果。