然后按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。
3．可溶性糖的提取
将样品剪碎混匀，称取0.10～0.30g，其3份。分别放入3支刻度试管中，加入5～10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
4．显色测定
吸取0.5ml样品液于20ml刻度试管中（重复2次），加蒸馏水1.5ml，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入蒽酮，浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算样品中糖的含量。
5． 注意事项
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与已糖，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。
三、作业思考题
1．鉴定植物抗寒性的方法有哪些？各有何优缺点？
2．干扰可溶性糖测定的主要因素有哪些？如何避免？
3．过氧化氢酶与哪些生化过程有关？
4．在进行超氧物歧化酶（SOD）活力的测定时，为什么设照光和黑暗两个对照管？影响该实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？
我国植物种类繁多，分布区域广，在晚秋和早春时期发生的冻害和冷害两种低温危害，常常给越冬作物和果木造成严重伤害。冻害由0℃以下低温造成，冷害由0℃以上低温引起，冷害对植物的伤害程度，除取决于低温外，还取决于低温维持时间的长短。植物抗寒性的强弱决定其生长季节，因此蔬菜作物利用抗寒品种，可以将露地栽培提前，提早供应市场；而选育抗寒性强的果树品种，不仅是寒带果树育种者的主攻方向，而且也是温带甚至热带果树育种者重要育种目标之一。
本实验重点学习实验室间接鉴定果树抗寒性的方法和步骤。
一、试材及用具
1．试材及处理：植物枝条或花朵，将采回的枝条剪成40cm左右的长度，用自来水冲洗数遍（洗掉泥土、灰尘、虫卵），再用蒸馏水冲洗三次，然后用吸水纸吸干水分，最后将枝条末端进行蜡封。将每个品种蜡封后的枝条分成相等的6份，其中一份作为对照，其余每份作为一个低温处理，放于冰箱中（0℃～4℃）保存备用。每次处理时，各取参试品种的一份枝条放于超低温冰箱或程控冰箱内进行低温处理，处理温度梯度为：CK（0℃），-20℃，-25℃，-30℃，-35℃，-40℃。降温速度为4℃/h，达到目的处理温度后维持12h，然后逐步升温，升温速度亦为4℃/h。花朵的处理温度梯度为：CK（0℃），-1℃，-3℃，-5℃，-6℃，-7℃，-8℃。
2．仪器 烘箱，发芽箱，培养皿，标牌，电导仪，具塞刻度试管（20ml），恒温水浴锅，温度计，玻璃棒，天平，研钵，石英砂，高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（4000lx），容量瓶（250ml、25ml），聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳槽，刻度吸管（10ml、5ml），离心管等。
二、内容说明
植物的抗寒性鉴定可分为田间鉴定和实验室间接鉴定两种方法。
1．田间鉴定 田间自然鉴定就是在冻害发生期（早春及晚秋）对受冻的田间植株一定器官、组织以一定的标准进行评价、比较，然后根据冻害情况评价抗寒性。
陈学森等（2001）对山东省春季“倒春寒”发生后，受害的核果类果树的花器官的抗寒性进行了调查，选出了当地花期抗寒性较强的红荷包、红丰等杏品种，证明种间的抗寒力大小顺序是：桃﹥杏﹥李﹥大樱桃。
赵玉田（1993）对不同生态型玉米的抗寒性进行了田间鉴定，测定的项目包括３个抗冷指标：
相对出苗率（%）（RER）：
幼苗干物重（SDW），取地上部三叶期10株幼苗，烘至恒重。
三个抗冷特性以总指数值（TIV）表示，即占各自等级顺序之和。其值反应了低温下种子出苗生长和干物质积累能力。
田间鉴定能最直接的反映不同品种在同一条件下的抗寒性差异。该法直接、简单，可进行大范围、大群体的评价，但受地域、品种数量的限制，只能比较少数几个同一地段的品种之间的抗寒力差异，不能对他们的抗寒能力进行量化。
2．实验室间接鉴定 实验室间接鉴定，就是根据作物某些生理生化指标及物理指标间接推断供试材料的抗寒性。
物理指标Lyons和Raison（1970）证明植物低温发生时，生物膜首先发生膜脂的物相变化，膜的外形和厚度发生变化，膜上产生龟裂，因而膜的透性增大，电解质大量外渗。抗寒性强的品种细胞膜透性增大程度轻，抗寒性差的品种与之相反。因此，测量电解质外渗量变化可以比较植物的抗寒性。在黑穗醋栗、梨、猕猴桃（Shaoli Lu，1990）等许多种果树的不同器官，如花、枝、叶等都有相似结论。另外，通过电导率值配以Logistic方程，可以求出半致死温度，确定植物的临界致死温度。
常用差示温度分析来测量深过冷。以DTA法测定，一般植物在零下几度即散热结冰，称为高温散热。经过低温锻炼的抗寒木本植物，在连续降温过程中，可见到有多次散热，第一次在零下几度，主要是细胞外结冰，最后一次散热可达-20～-45℃的低温以下，叫低温散热。在低温散热前一霎那的温度，即深过冷温度，用LTE温度表示。深过冷低温散热时，可出现细胞内结冰而使组织死亡。日本京都大学S.K.Kang（1998）等对苹果、桃、梨、柿子和葡萄5种落叶果树通过温度分析测定了两种散热HTE和LTE，发现柿子与葡萄仅有LTE，所有树种的低温散热温度与花芽的半致死温度一致。
生理生化指标主要包括超氧物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性测定及同工酶分析、丙二醛（MDA）及可溶性糖含量等方法。
(责任编辑：大汉昆仑王)
