摘要
棉花组织富含多糖、棉酚等次生代谢物质, 较难提取高质量的RNA。本研究在前人方法的基础上对快速提取棉花组织总RNA 的方法进行了探讨。利用改进的CTAB 异硫氰酸胍裂解缓冲液, 获得的RNA完整性好, 无DNA 污染, 含量高, 每克鲜组织能提取015mg 总RNA , OD260/ OD280比值均在117～210之间。该方法不但适用于叶片提取总RNA , 而且在根、花冠、种子、发育的纤维中均能提取出高质量的RNA , 同时节约成本, 相对于试剂盒提取RNA , 成本大为降低。
关键词
棉花组织, RNA , 提取
A Method of Total RNA Isolation in Cotton Tissues
Wen Xiaojie Zhang Guiyin Wang Xingfen Li Xihuan Ma Zhiying
Agricultural University of Hebei , Baoding , 071001
Corresponding author , mzhy @mail1hebau1edu1cn
ABSTRACT
The cotton tissues contain a lot of secondary metabolites such as phenolics , polysaccharides etc , thereforef rom which it is difficult to isolate high quality RNA.According to the prior research , a highly efficient ext raction method was modified1 High2concent ration and DNA2f ree RNA could be attained by using CTAB/ Guanidine Thiocyanate ext racion buffer1The total RNA can reach 1.7～2.0 of the OD260/ OD280 ratio with the yield of more than 015mg per gram of f resh tissues1 The method is suitable for high2quailty total RNA ext raction in leaves , root s , corollas , seeds and developing fibers. And the cost of this method is much lower compared with that using the commercicol kit of RNA ext raction.
KEYWORDS
Cotton tissues , RNA , Isolation
棉花组织RNA 的提取是进行棉花分子生物学研究的必要前提。进行Northern 杂交分析、体外翻译、建立cDNA 文库、RT2PCR 及差异显示分析等研究都需要高质量的RNA (李宏和王新力,1999 ; 赵双宜等, 2002) 。棉花组织中富含多糖、多酚等次生代谢物质, 在提取过程中, 多糖易与分子植物育种,2004 年,第2 卷,第1 期,第147 —150 页Molecular Plant Breeding ,2004 ,Vol12 ,No11 ,147 —150 RNA 共沉淀, 多酚类物质极易被氧化成红褐色物质, 然后与核酸不可逆的结合, 对RNA 的提取造成干扰。RNA 极易受到RNA 酶的影响而降解以及受到蛋白质、DNA 等的污染而降低RNA 的质量(Woodhead et al1 , 1997 ; Maliyakal , 1992 ) 。目前用于RNA 提取的试剂盒虽然操作简便、能快速提取植物组织RNA , 但其价格昂贵, 提取成本较高。本试验针对一些主要影响因素, 对快速简便提取棉花组织RNA 的方法进行了探索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料: 棉花品种为河北农业大学棉花育种研究室培育的“农大94 - 7”, 试验所用叶片、根、纤维、花冠、种子均取自新鲜组织。
1.1.2 试验药品: 异硫氰酸胍( Guanidine Thio-cyanate) 、丙烷磺酸(Moropholino ethanesulfonic acid ,MOPS) 、焦碳酸乙酯(Diethyl Pyrocarbonate , DEPC) 、β- 巯基乙醇(β- Mercaptoethanol) 购自Amresco 公司, 溴代十六烷基三甲烷(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide , CTAB) 、聚乙烯吡咯烷酮(PolywinyPyrro-lidone40 , PVP40) 、三羟基甲烷( TRIS) 、乙二胺四乙酸(Ethylenediamine teraacetic acid , EDTA) 等均购自Sigma 公司, 为超纯进口试剂, 其它试剂为一般分析纯化学试剂。
1.2 方法
1.2.1 试剂配制:
RNA 提取缓冲液: 4Mol·L - 1异硫氰酸胍, 0.1Mol·L - 1 Tris 碱(pH815) , 114 Mol·L - 1NaCl , 0.02Mol·L - 1 EDTA , 2 %CTAB , 2 %PVP40 , 1 %β- 巯基乙醇。
MOPs 缓冲液( 10 ×) : 0.4 Mol ·L - 1 MOPs(pH710) , 0.1 Mol·L - 1NaAc , 0.1 Mol·L - 1EDTA 。上样染料: 50 %甘油, 1 Mol ·L - 1 EDTA ,0.4 %溴酚蓝, 0.4 %二甲苯青。
其它试剂: 均需用DEPC 处理过的水配制,经高温灭菌待用, 或为新开封专门用于提取RNA的试剂。所用试剂瓶、电泳槽也需是无RNA 酶污染的, 一次性使用的塑料制品如枪头、离心管等可经高温灭菌后直接使用。
1.2.2 提取步骤
取1g 左右的棉花新鲜组织加入液氮迅速研磨成均匀的粉末, 转入10mL 离心管中, 加入3mL预冷的RNA 提取缓冲液混匀, 置于冰上; 每管依次加入3 Mol·L - 1 NaAc200μL , 酸酚3mL , 氯仿:异戊醇600μL ( 每加一种试剂都要轻摇混合均匀) , 冰浴15min ; 4 ℃条件下, 5 300rpm 离心30min , 吸上清于另一离心管中, 加入等体积氯仿: 异戊醇混匀; 4 ℃条件下, 5 300rpm 离心20min , 吸上清加入等体积的异丙醇混匀后置于-20 ℃冰箱冷冻1h 以上; 4 ℃条件下, 5 300rpm 离心30min , 去上清, 用70 %乙醇清洗2～3 次, 并转入115mL 离心管中, 干燥后溶于适量DEPC 水中, 取1μL 进行检测, 其余- 70 ℃冰箱中保存。
1.2.3 检测方法
1.2.3.1 变性琼脂糖凝胶电泳(王关林和方宏筠,1998)
a 凝胶制备: 称取0125g 琼脂糖, 加入20mL 蒸馏水, 微波炉加热溶解, 待胶凉至60～70 ℃, 依次加入4.5mL 甲醛, 2.5mLMOPs 缓冲液(10 ×) 和0.2μL 溴化乙锭, 混合均匀, 灌制琼脂糖凝胶。
b 样品准备: 取0.5mL 小离心管, 依次加入试剂: MOPs 缓冲液(10 ×) 2μL , 甲醛3.5μL ,甲酰胺10μl , RNA 样品4.5μL , 混匀, 将离心管置于65 ℃水浴中保温10min , 再置冰上2min , 向管中加入3μL 上样染料, 混匀点样。
c 电泳条件: 1 ×MOPs 缓冲液, 电压120V ,时间15min。
1.2.3.2 非变性琼脂糖凝胶电泳: 111 %琼脂糖凝胶, 015 ×TBE 缓冲液, 120V , 电泳15min。
2 结果分析
2.1RNA 质量分析
总RNA 的完整性对cDNA 的合成及PCR 过程有很大影响, 本方法从棉花组织中提取的总RNA , 无论是变性还是非变性琼脂糖凝胶电泳,都可以检测到28s、18s、5s rRNA 三条带, 且28srRNA 的条带较亮, 亮度基本为18s rRNA 的两倍(图1) , 没有拖带现象, 表明所提取的RNA 样品较为完整, 基本无降解, 可直接用于cDNA 合成
(图2) , 进行cDNA - AFL P 分析(图3) 。
2.2 RNA 纯度及产率
所取的棉花组织总RNA 稀释后经BECKMAN
DU800 紫外分光光度计检测, 所有样品OD260/
OD280均在118～210 之间, 表明酚类物质和蛋白
质等杂质少, 该方法所提取的RNA 样品纯度较
好, 同时, 测得幼叶RNA 浓度大约650ng·μL - 1 ,
浓度较高。(表1)
3 讨论
近年来, 对RNA 提取方法已有许多报道, 但适合棉花RNA 提取的方法并不多, 而且存在着费用高,操作时间长等弊端。本试验针对提取的主要影响因素进行摸索, 建立了一个简单快速提取棉花组织RNA的方法。棉花组织富含棉酚、多糖等次生代谢物质,为其RNA 提取带来困难。酚类物质会随着植物的生长而增加, 因此本试验所用材料均为幼嫩新鲜组织。由于酚类物质极易被氧化为褐色物质进而与RNA 稳定结合, 影响RNA 的分离纯化。β- 巯基乙醇能防止酚类物质的氧化, PVP40 中的CO - N = 有很强的结合酚类化合物的能力, 与其形成稳定的复合物, 使之在以后的抽提步骤中被除去(李宏和王新力, 1999) 。缓冲液中同时使用还原剂β- 巯基乙醇和螯合剂
PVP40 , 有效的降低了酚类物质的影响。多糖是RNA提取中的又一主要障碍, 多糖的许多理化性质与RNA 相似, 很难将它们分开, 在沉淀RNA 时很容易产生多糖的胶状沉淀, 难溶于水, 同时多糖可抑制许多酶的活性, 为RNA 样品的进一步分子生物学研究带来困难。本试验通过提高盐离子浓度(王文锋等,2002) , 酚、氯仿: 异戊醇进行抽提去除多糖, 缓冲液中加入高浓度的NaCl , 抽提前又加入3M的NaAc ,增加了Na 浓度, 减少了多糖的干扰。另外, 提取缓冲液中利用CTAB 和异硫氰酸胍相结合, CTAB 是一种较强的去污剂, 对蛋白的变性效果明显强于SDS。如图1 所示: 1、2 泳道为CTAB 法提取的RNA , 3、4 泳道为SDS 法所提取; 异硫氰酸胍是一种强烈变性剂, 与CTAB 共同作用能迅速溶解蛋白, 导致细胞结构破碎, 在β- 巯基乙醇及PVP40 的作用下还可抑制棉酚对细胞器内脂肪、多糖及蛋白质的氧化作用(赵双宜等, 2002 ; 徐亚浓等, 2002) 。与其它现有的棉花总RNA 提取方法相比, 直接用酸酚、氯仿:异戊醇一次抽提, 去除蛋白较彻底, 节省了操作步骤和时间, 由于棉花花冠、幼胚含蛋白较多, 可以用氯仿:异戊醇多次抽提直到分界面干净; 同时利用酸酚抽提促使RNA 进入水相, 而DNA 留在有机相, 降低了DNA 的污染。用异丙醇沉淀RNA , 避免了LiCl 沉淀所需时间长(3h 以上) 的缺点。本试验整个操作过程所需时间不足4h , 因此该方法能快速获得RNA ,而且操作均在低温条件下进行, 减少了RNA 降解的
可能性。另外, 在提取过程中, 一定要严格操作,Rnase 无处不在, 非常稳定, RNA 极易降解, 所需器皿、场地、药品应为提取RNA 所专用, 并且用DE-PC处理之后高温灭菌, 操作人员自身也要严格要求,操作过程中使用一次性手套, 而且需要经常更换, 尽量减少交谈和人员流动, 以防止外源Rnase 污染。
经试验该方法适合棉花各组织总RNA 的提取, 与已有的提取方法相比操作步骤简单, 提取成本低, 能快速获得高质量、高纯度的RNA , 为进一步分子生物学研究奠定了基础。
(责任编辑：大汉昆仑王)
