引用TRIzol RNA提取步骤系列问题

TRIzol RNA 提取试剂盒是由 GIBCO BRL 公司推出专供提取 RNA 的产品，其操作方便、快捷。

（一）试剂准备
1 ． TRIzol 试剂。
2 ．氯仿
3 ．异丙醇
4 ． 75% 乙醇（ DEPC H2O 配制）
5 ． DEPC H2O

（二）操作步骤
1 ． 样品处理：
（１）培养细胞：收获细胞 1-5×10 7 ，移入 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol ，混匀，室温静置 5min 。
（２）组织：取 50-100mg 组织（新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol 充分匀浆，室温静置５ min 。
2 ．加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s ，静置 2min 。
3 ． 4 ℃ 离心， 12000g × 15min ，取上清。
4 ．加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min 。
5 ． 4 ℃ 离心， 12000g × 10min ，弃上清。
6 ．加入 1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4 ℃ ， 7500g × 5min ，弃上清。
7. 晾干，加入适量的 DEPC H 2 O 溶解（ 65 ℃ 促溶 10-15min ）。

（三）注意事项
1 ．样品量和 Trizol 的加入量一定要按步骤（ 1 ）的比例，不能随意增加样品量或减少 Trizol 量，否则会使内源性 RNase 的抑制不完全，导致 RNA 降解。
2 ．实验过程必须严格防止 RNsae 的污染。

二、总 RNA 定量
RNA 定量方法与 DNA 定量相似。 RNA 在 260nm 波长处有最大的吸收峰。因此，可以用 260nm 波长分光测定 RNA 浓度， OD 值为 1 相当于大约 40 μ g/ml 的单链 RNA 。如用 1cm 光径，用 ddH 2 O 稀释 DNA 样品 n 倍并以 ddH 2 O 为空白对照，根据此时读出的 OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度：
RNA （ mg/ml ） =40 × OD 260 读数×稀释倍数 (n)/1000
RNA 纯品的 OD 260 /OD 280 的比值为 2.0 ，故根据 OD 260 /OD 280 的比值可以估计 RNA 的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示 RNA 有降解。

常见问题

一.组织RNA提取

1.最好新鲜组织，这样RNA提取的效果比较好，这是肯定的。

2.如果不是新鲜的（最好在半年之内，-80℃或者液氮中冻存的）组织，注意不要反复冻融，从冰冻状态拿到0-4℃，注意不要拿到常温，待组织解冻后，用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织，称重后，放到预冷的匀浆器中，然后加入一定量的TRIZOL试剂，然后匀浆。

注意：速度不要太快，要匀一会挺一会，否则由于摩擦产热，RNA遇热会加速降解。如果一次做多个标本的RNA提取，也要这样做，更不能急。后面的步骤和细胞RNA提取一样。

二.培养细胞的RNA提取

1.贴壁细胞，需要先用胰酶消化后，然后收集到离心管中，离心，去上清，然后用PBS多洗2-3次，以去除多余的胰酶。
悬浮细胞，直接用吸管或者加样枪吹打评壁，以使细胞基本可以被吹下来。然后离心去上清，不需要用PBS洗。

2.然后将少量细胞悬液转移到预冷的DEPC泡过的1.5毫升EP管中，然后加入一定量的TRIZOL(细胞多的话加1毫升，细胞少的话加0.5毫升就可以)，然后用枪头吹打混匀5-10分钟。（如果有时间就继续往下做，如果没有时间，可以把加了TRIZOL后的细胞裂解液冻存到-80℃，用的时候提取和新的提取的效果一样。）在冰上操作。

3.上面的混匀5-10分钟，基本可以使细胞裂解，然后可以进行下面的步骤，详细的步骤我就不介绍了。

我只介绍一些需要注意的地方。

1.一定要注意冰上操作，低温离心。

2.戴口罩和勤换手套，去任何东西都要带着手套去取。

3.每次去器材的时候都要用镊子去夹，镊子要在酒精灯上烧一下。

4.所有的器材都要经过DEPC浸泡后高压后才可以使用，所需要的氯仿，酒精，异丙醇等都保证没有被RNA酶污染，不能用没有泡过DEPC的枪头去提取液体，一定要用DEPC浸泡过的枪头去吸，如果发现试剂有可能被污染了，要立即更换。

5.吸取上清一定不要吸到中间层的蛋白，如果吸到蛋白一定要重新用氯仿抽提，因为，吸到的蛋白很可能会对RNA产生降解作用。一定要少吸，不要贪多，RNA提取不要求量，更多的要求质。

6.最后用75%的酒精洗一次就可以，尽量减少RNA提取时间。

7.最后一步，用DEPC水溶解RNA，不要用太多的体积，以保证RNA的浓度。
提取完后，电泳观察结果，如果上面的两条带都比较清楚的话，说明RNA提取的不错，可以一次多逆转录几管，不要把RNA冻存，以后在逆转录的效果不好。

(责任编辑：大汉昆仑王)