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引用TRIzol RNA提取步骤系列问题

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6327

TRIzol RNA 提取试剂盒是由 GIBCO BRL 公司推出专供提取 RNA 的产品,其操作方便、快捷。

(一)试剂准备
1 . TRIzol 试剂。
2 .氯仿
3 .异丙醇
4 . 75% 乙醇( DEPC H2O 配制)
5 . DEPC H2O

(二)操作步骤
1 . 样品处理:
(1)培养细胞:收获细胞 1-5×10 7 ,移入 1.5ml 离心管中,加入 1ml Trizol ,混匀,室温静置 5min 。
(2)组织:取 50-100mg 组织(新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可)置 1.5ml 离心管中,加入 1ml Trizol 充分匀浆,室温静置5 min 。
2 .加入 0.2ml 氯仿,振荡 15s ,静置 2min 。
3 . 4 ℃ 离心, 12000g × 15min ,取上清。
4 .加入 0.5ml 异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置 10min 。
5 . 4 ℃ 离心, 12000g × 10min ,弃上清。
6 .加入 1ml 75% 乙醇,轻轻洗涤沉淀。 4 ℃ , 7500g × 5min ,弃上清。
7. 晾干,加入适量的 DEPC H 2 O 溶解( 65 ℃ 促溶 10-15min )。

(三)注意事项
1 .样品量和 Trizol 的加入量一定要按步骤( 1 )的比例,不能随意增加样品量或减少 Trizol 量,否则会使内源性 RNase 的抑制不完全,导致 RNA 降解。
2 .实验过程必须严格防止 RNsae 的污染。

二、总 RNA 定量
RNA 定量方法与 DNA 定量相似。 RNA 在 260nm 波长处有最大的吸收峰。因此,可以用 260nm 波长分光测定 RNA 浓度, OD 值为 1 相当于大约 40 μ g/ml 的单链 RNA 。如用 1cm 光径,用 ddH 2 O 稀释 DNA 样品 n 倍并以 ddH 2 O 为空白对照,根据此时读出的 OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度:
RNA ( mg/ml ) =40 × OD 260 读数×稀释倍数 (n)/1000
RNA 纯品的 OD 260 /OD 280 的比值为 2.0 ,故根据 OD 260 /OD 280 的比值可以估计 RNA 的纯度。若比值较低,说明有残余蛋白质存在;比值太高,则提示 RNA 有降解。

常见问题

一.组织RNA提取

1.最好新鲜组织,这样RNA提取的效果比较好,这是肯定的。

2.如果不是新鲜的(最好在半年之内,-80℃或者液氮中冻存的)组织,注意不要反复冻融,从冰冻状态拿到0-4℃,注意不要拿到常温,待组织解冻后,用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织,称重后,放到预冷的匀浆器中,然后加入一定量的TRIZOL试剂,然后匀浆。

注意:速度不要太快,要匀一会挺一会,否则由于摩擦产热,RNA遇热会加速降解。如果一次做多个标本的RNA提取,也要这样做,更不能急。后面的步骤和细胞RNA提取一样。

二.培养细胞的RNA提取

1.贴壁细胞,需要先用胰酶消化后,然后收集到离心管中,离心,去上清,然后用PBS多洗2-3次,以去除多余的胰酶。
悬浮细胞,直接用吸管或者加样枪吹打评壁,以使细胞基本可以被吹下来。然后离心去上清,不需要用PBS洗。

2.然后将少量细胞悬液转移到预冷的DEPC泡过的1.5毫升EP管中,然后加入一定量的TRIZOL(细胞多的话加1毫升,细胞少的话加0.5毫升就可以),然后用枪头吹打混匀5-10分钟。(如果有时间就继续往下做,如果没有时间,可以把加了TRIZOL后的细胞裂解液冻存到-80℃,用的时候提取和新的提取的效果一样。)在冰上操作。

3.上面的混匀5-10分钟,基本可以使细胞裂解,然后可以进行下面的步骤,详细的步骤我就不介绍了。

我只介绍一些需要注意的地方。

1.一定要注意冰上操作,低温离心。

2.戴口罩和勤换手套,去任何东西都要带着手套去取。

3.每次去器材的时候都要用镊子去夹,镊子要在酒精灯上烧一下。

4.所有的器材都要经过DEPC浸泡后高压后才可以使用,所需要的氯仿,酒精,异丙醇等都保证没有被RNA酶污染,不能用没有泡过DEPC的枪头去提取液体,一定要用DEPC浸泡过的枪头去吸,如果发现试剂有可能被污染了,要立即更换。

5.吸取上清一定不要吸到中间层的蛋白,如果吸到蛋白一定要重新用氯仿抽提,因为,吸到的蛋白很可能会对RNA产生降解作用。一定要少吸,不要贪多,RNA提取不要求量,更多的要求质。

6.最后用75%的酒精洗一次就可以,尽量减少RNA提取时间。

7.最后一步,用DEPC水溶解RNA,不要用太多的体积,以保证RNA的浓度。
提取完后,电泳观察结果,如果上面的两条带都比较清楚的话,说明RNA提取的不错,可以一次多逆转录几管,不要把RNA冻存,以后在逆转录的效果不好。
 

(责任编辑:大汉昆仑王)
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