T细胞尼龙毛柱分离法

互联网2013-08-19

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在研究体内及体外的免疫系统时，分离淋巴细胞群是一个关键步骤。因为现在市场上并没有针对 B 细胞的特异性抗血清，所以分离淋巴细胞中的 T 细胞并不是十分方便。 T 细胞尼龙毛分离法利用了尼龙毛对 B 细胞的亲和力，从而使 T 细胞在没有严重损伤的情况下达到的足够的纯度。因为这个方法不像流式和磁珠费用昂贵，而且操作简便，所需要的条件也不高，是一种非常实用的方法。 ( 在此我向各位解释一下，现在分离 T 细胞的方法主要是三种，流式，磁珠法，尼龙毛法。与前两种方法相比，尼龙毛法的优势在于无需特定的设备仪器，一般的实验室均有条件操作；价格相对低廉；可以进行大量样本操作。 ) 首先要指出的是实验中所使用的是分离 T 细胞专用的尼龙毛 (Nylon Fiber) ，不是化工上的尼龙纤维，曾经有人问过我这种问题，如果你买错了，可是做不出来的！其次，现在市面上的尼龙毛也是良隽不齐，也有同仁反应买到的尼龙毛加入缓冲液以后成了一团糨糊，根本没法使用，这个问题就要靠各位的慧眼了。 现在市面上有尼龙毛填料，也已经有了商品化的尼龙毛柱子，这两者的区别主要是以下两点： 1. 商品化的柱子的填料量是已经定好的，有一个确定的上样量范围。而自己买填料装柱可以控制填料量，也就是可以控制上样量，这对于样本量非常少，或是样本量非常大的实验需求非常合适。 2. 商品化的柱子已经经过了无菌处理 ( 一般是辐射灭菌 ) ，而自己装柱当然就要自己灭菌了。 3. 商品化的柱子在实验的重复性上有着绝对的优势。自己装的柱子在填料的处理和装柱的松紧等方面不容易控制，差异性的控制就看你的实验技巧了。 操作方法： 1. 秤取 1.5g 尼龙毛装入 20-30ml 玻璃或一次性注射器内 ( 要可以灭菌的 ) ，填料的体积控制在 15 毫升左右 ( 注射器上有标记，所以还是比较好控制的 ) ，因为尼龙毛的松紧关系到 T 细胞的回收率，所以要特别注意。注射器下端配接 5 厘米 左右长的带有弹簧夹的橡皮管。 2. 加入大量的 PBS 平衡柱子后，用铝箔包裹，并置于适当的容器内，高压灭菌 15 分钟。 （商品化尼龙毛柱以上步骤可以省略，经过无菌 PBS 平衡后直接进行下列步骤。） 3. 灭菌的尼龙毛柱垂直固定后放于超净台内，顶部以铝箔覆盖，避免污染。 4. 橡皮管，弹簧夹用无水酒精消毒后接注射器下端，打开弹簧夹调节流速在大约 3-4ml/min 。 5. 首先，加入 3-4 倍柱体的无血培养基平衡；随后，之后加入相同体积的含有血清的培养基平衡（上述培养基都要预热），最后等培养基页面接近柱填料页面时，关闭弹簧夹。 6. 样本细胞悬浮液浓度控制在 5×108cells/ml 的，上样量一般是 1/3-1/5 柱体积 ( 商品化的柱子一般都有推荐上样量 ) 。样品加入之后，再加入少量培养液，然后关闭弹簧夹。 7. 柱上覆盖铝箔，移置于消毒过的容器中， 37 ℃ 孵育 1 小时。此过程中柱子必须要保持垂直状态。 8. 从培养箱中拿出柱子，置于超净台内，除去铝箔。接上按照 4. 中的方法消毒的弹簧夹和橡皮管，加入适当体积经 37 ℃ 预热的培养基，打开弹簧夹控制流速在 3-4 mL/min ，流出约 5ml 之后，流出的培养液基变得不透明，此时其中含有 T 细胞，收集这一部分培养基。 9. 基本上何时结束收集取决于流出液体中细胞的浓度，实际上，收集的量达到一个柱体积时就可以停止收集，因为即使收集更多的量，回收率几乎不会增加。 10 。参考数据：

样本：小鼠脾脏（ T 细胞含量在 30-40% ， B 细胞含量在 55-60% ）

细胞回收率： 13-25%

B 细胞污染率：小于 15%

样本：大鼠脾脏（ T 细胞含量在 30-35% ， B 细胞含量在 55-65% ）

细胞回收率：大于 25%

B 细胞污染率：小于 15%

样本：人或兔外周血

细胞回收率 : 20-30% ( 人 ) ； 25-35% ( 兔 )

B 细胞污染率：小于 5% ( 人、兔 )

（注）收集粘附于尼龙毛上的细胞时，将 T 细胞收集完毕后的尼龙毛在无菌操作的状态下取出，转移到适当的容器中，用镊子小心的将尼龙毛松开，粘附的细胞可以洗到培养基中。或者将注射器芯插入注射器内，通过压力使的粘附的细胞随着液体流出。

(责任编辑：大汉昆仑王)