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Rt-PCR经验总结

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1683

Rt-PCR实验步骤
一、实验器具与材料:
1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸头:1ml、200μl、20μl
3、匀浆管:5ml
4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个
5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl
6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖)
1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)
7、量筒:50ml、250ml、500ml
8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml
9、试管架:5ml、1.5ml、20μl
10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水
11、铝制饭盒:4个
12、塑料小饭盒:1个
13、大瓷缸:2个
14、锡泊纸:一卷
15、卷纸:2卷
16、三角烧瓶:带盖,稍大

 

二、实验器具的处理与准备
1、塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)
先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)
2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干)
3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压3次(不需要泡DEPC)

三、试剂配制:
1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇:用无水乙醇+DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)
3、异丙醇:放入棕色瓶中
4、氯仿:放入棕色瓶中
5、琼脂糖
四、几种缓冲液的配制:
1、电泳缓冲液:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5M EDTA 20ml? pH8.0
蒸溜水 1000ml

5×TBE (贮存液)
再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液+450ml水——→500ml工作缓冲液

2、上样缓冲液:
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
30%甘油

6×缓冲液,4℃保存

五、琼脂糖凝胶的配制:
1、1.0%:
1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳。

2、1.5%:
同上,将琼脂糖的量改为1.5g

六、需购置的Rt-PCR材料:

Taq酶(含MgCl2 Buffer) 200u 70.00
dNTP: 1支
oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支 110
—— -20℃

 

DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
—— 4℃

Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
(1543. 994. 697. 515. 377. 231)
七、引物合成
1、内参照:
GAPDH
正义:5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′
反义:5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′

β-actin
正义:5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′
反义:5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′

2、par-4:
正义:5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′
反义:5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′

3、退火温度计算
2(A+T)+4(G+C)
正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)

4、引物各合成5 OD,每OD一瓶分装好

5、引物稀释:
加DEPC水量为(μl)
= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100
是为10p mol / μl 浓度的引物溶液

八、PCR产物电泳
先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。

九、几个注意点:
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴?
2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。
3、RNA抽提前,打开离心机预冷。

在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。

(责任编辑:大汉昆仑王)
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