六、需购置的Rt-PCR材料:
Taq酶(含MgCl2 Buffer) 200u 70.00
dNTP: 1支
oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支 110
—— -20℃
DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
—— 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
(1543. 994. 697. 515. 377. 231)
七、引物合成
1、内参照:
GAPDH
正义:5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′
反义:5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′
β-actin
正义:5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′
反义:5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′
2、par-4:
正义:5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′
反义:5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′
3、退火温度计算
2(A+T)+4(G+C)
正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)
4、引物各合成5 OD,每OD一瓶分装好
5、引物稀释:
加DEPC水量为(μl)
= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100
是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、PCR产物电泳
先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。
九、几个注意点:
1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴?
2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。
3、RNA抽提前,打开离心机预冷。
在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
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