骨髓标本的准备

（一）骨髓穿刺术
适应证和禁忌证
1．适应证  骨髓细胞学检验是诊断血液系统疾病的最重要手段。临床上出现不明原因下列情况时，可做骨髓细胞学检查。
（1）外周血细胞成份及形态异常：如一系、二系或三系减少，一系、二系或三系增多，一系增多伴二系减少等，外周血中出现原始细胞、幼稚细胞等异常细胞。
（2）发烧，肝肿大，脾肿大，淋巴结肿大。
（3）骨痛，骨质破坏，肾功能异常，黄疸，紫癜，血沉明显增加。
（4）化疗后的疗效观察。
（5）其他：骨髓活检、骨髓细胞免疫表型分析、造血祖细胞培养、染色体核型分析、微生物及寄生虫学检查（如伤寒、副伤寒、疟疾、恶心、败血症）等。
2．禁忌证  凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病；穿刺部位有炎症或有畸形；晚期妊娠的妇女做骨髓穿刺时要慎重。
试剂器材
骨髓穿刺针、消毒孔巾、一次性消毒采血针、2%利多卡因、络合腆和乙醇、无菌手套、消毒干棉球及纱布、胶带、玻片。
操作步骤
1．选择体位  穿刺部位不同其体位也有所不同。如髂骨后上棘采用侧卧位或俯卧位，髂骨前上棘采用仰卧位。
2．定位  髓骨后上棘穿刺点为脊柱两旁臀部上方突出的骨性标志，约相当于第5腰椎的水平；髂骨前上棘穿刺点为髂前上棘顶端往后约1~2cm处；胸骨穿刺点为第2、3肋间隙所对应的胸骨中点，或与胸骨体交接处的胸骨体。确定穿刺点后,标上"十"字形记号,然后甲紫标记。
3．常规消毒  用络合腆和乙醇按无菌操作要求进行常规消毒,打开已消毒的骨髓穿刺包,带上无菌手套，铺上孔巾。
4．局部麻醉  2%利多卡因，在皮内注射形成一小皮丘，然后垂直进针，直到骨膜，边进针边注局麻药，并以穿刺点为中心，多点麻醉其周围的骨膜。拔针后，局部轻轻按摩片刻。
5．进骨髓穿刺针  将穿刺针套上针芯，调整固定器离针尖约1~1.5cm，左手拇指和示指固定穿刺部位的皮肤，右手持穿刺针从穿刺点沿垂直方向左右旋转进针(胸骨穿刺除外)，直至骨皮质时阻力增加，再用力后阻力突然下降，穿刺针固定表明已进入了骨髓腔。
6．抽吸骨髓液  拔除针芯，套上干燥的无菌针筒，抽吸骨髓液约0.2mL，置于事先准备好的干净玻片上，由助手立即涂片。
7．拔出骨髓穿刺针  取针筒后，套上针芯，将整个穿刺针拔出。
8．包扎伤口  用消毒纱布压迫伤口，用络合腆消毒穿刺点然后敷以消毒纱布，胶布固定，或盖以创可帖。
注意事项
1．对于初诊的患者，骨髓穿刺检查要在治疗前进行。
2．整个骨髓穿刺操作过程严格按无菌操作，防止骨髓感染。
3．抽吸骨髓之前，注射器内留存少量的空气，以方便将注射器乳头内的骨髓液挤出。抽吸骨髓液时量不宜过多，一般以小于0.2mL为宜，以免骨髓液被外周血稀释。如同时需要做有核细胞计数、细菌培养、造血细胞培养、染色体分析、免疫表型分析等其他检查时，应先抽少许作骨髓涂片，然后再抽取一定量骨髓液(肝素抗凝)送检。
4．骨髓取材良好的指标包括：①在骨髓液抽出的一瞬间，患者有特殊的疼痛感觉；②肉眼见骨髓液中应含有骨髓小粒；③显微镜下可发现骨髓特有细胞，如幼红细胞、幼粒细胞、巨核细胞、浆细胞、成骨细胞、破骨细胞、脂肪细胞、肥大细胞、组织细胞、纤维细胞等；④有核细胞数大于外周血有核细胞数，骨髓中性杆状核粒细胞/分叶核粒细胞比值大于外周血中性杆状核粒细胞/分叶核粒细胞比值。
5．骨髓稀释与干抽
(1)完全稀释与血片完全一样。
(2)部分稀释骨髓小粒、油滴少或不见，骨髓特有细胞少，有核细胞少，成熟细胞/幼稚细胞>3/5。
(3)干抽(dry tap)是指非技术错误或穿刺位置不当而抽不出骨髓液或只抽到少量血液。常见于：①原发性和继发性骨髓纤维化症；②骨髓极度增生，细胞过于紧密结实，如白血病、真性红细胞增多症等；③骨髓增生减低，如再生障碍性贫血；④肿瘤骨髓浸润,包括恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓转移癌。当发生干抽时，在针头中有时可有少量骨髓组织，如用针心将其推出，可以制作一张涂片，仍可供检查。一般可更换部位再行穿刺，部分病例(如骨髓纤维化)必须做骨髓活检。
6．做骨髓细胞学检查时，同时取外周血涂片一并送检。
7．送检的标本要有标识性的记号，以免出现差错。
（二）骨髓涂片制备及染色技术
1、涂片制备
操作步骤
取小绿豆大小的血滴或相当量的骨髓液置于玻片的一端，将推片一侧或一端置于血滴上,并将推片稍向后移，使血滴沿推片边缘散开，然后使推片与玻片成一定夹角，将推片均匀地移向玻片的另一端，使血滴在玻片上形成均匀的血膜。
注意事项
（1）玻片要干净，推片的边缘必须平整光滑。
（2）血滴或骨髓置玻片上后应立即涂片，否则就会凝固，影响阅片的效果。
（3）一张好的涂片应该是有头、有体、有尾；厚薄适当，分布均匀。血滴大小应适中，血滴太少，涂片太短；血滴太大，涂片过长，则没有尾。
（4）因骨髓中含有骨髓小粒和脂肪，有核细胞数量多，较血液粘稠，在推片时角度应略小些，速度要慢些。推片与玻片的夹角约为30°~45°，夹角大，血膜就厚；夹角小，血膜则薄。
（5）推片的速度应适中，速度过快，涂片就会过厚；速度太慢，涂片则太薄。
（6）做骨髓涂片检查时，应制片至少6~10张，全部送检，以备其他检查所用。在涂片血膜未干之前，不能互相叠放。同时制备外周血涂片一并送检，以便进行比较观察。
（二）染色
瑞氏(Wright)染色法是目前应用最为广泛的染色法之一。
染色原理
瑞氏染料中含有伊红及亚甲蓝。伊红呈酸性，亚甲蓝呈碱性，细胞核中核酸和蛋白质以及原始细胞的胞质均为酸性物质，可与亚甲蓝起作用而被染成蓝色；同时，胞质中的血红蛋白可与伊红起作用而被染成淡红色。又因为酸碱度的变化可影响蛋白质与染料结合，瑞氏染色法的pH为6.4~6.8。加上缓冲液的目的是：偏碱性的染料可与缓冲液中的酸基起作用，偏酸性的染料可与缓冲液中的碱基起作用，因此能维持染色的一定酸碱度，使细胞的结构更清晰可辨。
试剂器材
瑞氏染液、蜡笔、洗耳球、置片架。
操作步骤
先用蜡笔在涂片的两端、血膜或骨髓膜的外侧画上一道，以防止染液外流，然后滴染液数滴盖满整个血膜部分，约10秒后加缓冲液，染液与缓冲液的量之比约为1:2~1:3，用洗耳球轻轻吹动液体，使其混匀；约15min(天气较冷，细胞较多时，染色时间需较长；相反，天气较热，细胞较少时，染色时间需稍短)后，便可用流水将染液冲洗掉，将涂片立于置片架晾干。
注意事项
（1）染液必须足量，染液过少在染色过程中挥发变浓，易在涂片上留下沉淀物。
（2）冲洗时先不必将染液倒掉，直接在流水下冲洗，否则易在涂片上留下沉淀物。
（3）染色后发现涂片细胞染色过浅，还可复染一次，复染时先加缓冲液，后加瑞氏染液，用洗耳球使两液混匀。
（4）染色时不要一次性将所有涂片染完，应留有涂片以备加做其他检查之需，同时也避免因染色失败影响检验结果。