使用Hoecsht 33258荧光染料定量DNA

1. 应用说明

在分子生物学的许多试验中，DNA定量都是一个很重要的步骤。用到DNA的常用技术有序列分析、cDNA合成和克隆、RNA转录、转染、核酸标记（比如随机引物标记）等等，这些试验的好坏取决于所使用模板浓度，对所用DNA模板浓度错误估计往往是导致这些实验失败的最直接原因。

核酸的浓度通常用紫外，在260nm波长处，测吸光值获得，检测中的灵敏性会受到很高的背景干扰。Hoechst 33258，一种二苯甲亚胺DNA结合物，在检测时会有比紫外激发更强的荧光产生，检测更灵敏。它在紫外区(350nm)附近被激发，发射波在蓝光区(450nm)，检测dsDNA的灵敏度是10ng/ml（见图 1）。

 

图 1 用Hoechst染料和紫外激发光对dsDNA定量分析，加2倍Hoechst染料工作液之前，用1倍的TNE对1 μg/ml的DNA做倍比稀释，平衡5min后，将100μl样品转移到微量检测检测皿中读数。

2. 所需材料

●Modulus^TM 单管型多功能检测仪 （货号：9200-000或9200-002）

●紫外荧光模块（货号：9200-041）

●微量比色杯（货号：7000-950）和微量适配器（货号：9200-928）或比色杯（货号：7000-959）

●Hoechst 33258 10 mg/ml (分子探针 H3569)

●10XTNE储存缓冲液

●0.45μm的过滤水

3. 考虑因素

3.1 DNA样品中的AT含量会影响到Hoechst 33258-DNA荧光，因此，检测样品时设一对照是非常重要的，小牛胸腺DNA由于是双链、高度聚合并含有大约58%的AT（42% GC）而经常被用作动植物DNA的对照。对于细菌DNA来说，它会有不同的对照，因为不同菌种的AT含量变化较大。

3.2 不同构造的质粒DNA（超螺旋型、螺旋型、环形和、线型）会有不同的Hoechst 33258结合效果。因此，选择一种与样品特征相似的标准品对照也是很重要的。

3.3 在单链基因组DNA上的Hoechst 33258荧光只有在双链基因组DNA上的一半，单链DAN片段的荧光量并不会与单链DAN的浓度成比例地引发荧光。

3.4 用于全细胞DNA抽提的缓冲液对后期的检测没有什么影响。

3.5 少量的去污剂（＜0.01% SDS）对检测也没有什么影响。

3.6 含盐浓度为3M NaCl的DNA抽提样对检测没有影响。为获得较强的荧光，纯化的DNA样品中至少要含有200mM的NaCl，未纯化样品中需含2.0-3.0M的NaCl。对于未纯化样品来讲，较高的盐浓度会将结合在DNA上的蛋白裂解下来，便于染料分子的结合。

3.7 RNA对检测没有影响，因为Hoechst 33258通常并不与RNA结合。来之于RNA的荧光信号通常会低于相同DNA浓度的1%。

4.试剂制备

4.1 Hoechst 33258储存液

1 mg/ml Hoechst 33258：1ml的Hoechst 33258（10 mg/ml）加9ml的用0.45μm滤膜过滤的蒸馏水稀释而成。

注：Hoechst 33258可能会致癌和导致基因突变，操作时须带手套、面罩，并且在通风橱内操作。

4.2 10XTNE储存缓冲液

溶解于800ml蒸馏水中：12.11g Tris碱[Tris（羟甲基）氨基甲烷]，分子量=121.14；3.72g EDTA乙二胺四乙酸，二钠盐，二水合物，分子量=372.20；116.89g 氯化钠，分子量=58.44。用浓盐酸调节溶液PH至7.4，补加蒸馏水定容至1000ml，使用前用0.45μm滤膜过滤，4℃可保存3个月。

注：PH和氯化钠浓度对于Hoechst试剂和DNA的结合至关重要。

1倍的TNE:用90ml蒸馏水（0.45μm滤膜过滤）稀释10ml 10倍的TNE。

4.3 准配2倍的染料液用于10-1000 ng/ml的DNA：用100ml的1倍的TNE稀释20ul Hoechst 33258 储存液 (1 mg/ml)，室温放置，现用现配，一旦染料加入千万别再过滤！

4.4 小牛胸腺DNA标准液：准备溶解在1倍TE浓度为1 mg/ml的小牛胸腺DNA储存液，轻击小管充分混匀，4℃可保存3个月。

5. 样品检测

5.1荧光模块的安装

5.1.1关掉多功能机电源开关，根据操作手册插入紫外荧光模块

5.1.2打开电源开关，校准前先预热1min。

5.1.3用于10X10mm比色杯的实验方案

5.1.3.1准备1ml 2000 ng/ml dsDNA标准液校准比色杯。

5.1.3.2以1:1的比例加2倍的染料工作液到2000ng/ml dsDNA标准液中，终浓度为1000ng/ml。

5.1.3.3在另外的小管中加入空白对照液：2倍的染料工作液以1:1的比例加入1X TNE缓冲液，最少2ml。

5.1.3.4校准多功能机用1000 ng/ml。

注：用一个和检测样品浓度相同或相近的标准样优化系统，使检测更精确。例如，若检测样品浓度在300 ng/ml，要用一个500 ng/ml标准DNA样。标准样浓度应该是与检测样浓度相同或超出100 ng/ml。

5.1.3.5保存这次校准以供将来使用（可选）

5.1.3.6向1ml样品的小管中加1ml 2倍的染料液，需要的话，可以用1倍TNE稀释样品。

注：小管中溶液体积最少需2ml。

5.1.3.7放入多功能机读数前平衡样品和染料混合液5min。

5.1.3.8样品和染料浓度会在多功能机显示屏上显示。

注：由于染料的加入，最终浓度要小于起始浓度的1/2。另外也要考虑到起始样品的稀释。

5.1.4使用微量比色杯的实验方案

5.1.4.1标准液制备。将1mg/ml 的DNA储存液用1倍TNE稀释到2μg/ml，加相等体积的2倍的染料工作液，而后重复步骤4.4，充分混合。

注：用一个和检测样品浓度相同或相近的标准样优化系统，使检测更精确。例如，若检测样品浓度在300 ng/ml，要用一个500 ng/ml标准DNA样。标准样浓度应该是与检测样浓度相同或超出100 ng/ml。

5.1.4.2空白对照液制备。在另一只小离心管中加入相同体积的样品缓冲液（通常是1倍TNE）和2倍的染料工作液。

5.1.4.3混合小离心管中加有2倍染料工作液的样品。

注：在微量比色杯中不要混合检测样、标准样或有染料液的空白对照液。

5.1.4.4取100μl检测样、标准样和空白对照液分别加到微量比色杯中，室温避光静置2-5min。

注：不要在微量比色杯中引入气泡，它会导致读数错误。

5.1.4.5校准多功能机用1000 ng/ml。

5.1.4.6保存这次校准以供将来使用（可选）

5.1.4.7微量比色杯中样品所测浓度会在多功能机显示屏上显示。

注：由于染料的加入，最终浓度要小于起始浓度的1/2。另外也要考虑到起始样品的稀释。

6. 关于ModulusTM单管型多功能检测仪

Modulus^TM 单管型多功能检测仪 是Turner Biosystems公司生产的一款单管型多功能检测仪，它具有生物与化学发光检测、荧光检测和光吸收检测三个功能。ModulusTM单管型多功能检测仪采用模块化设计, 可根据实验的需求, 选用相应的检测模块, 来完成生物与化学发光、荧光或光吸收检测.

(责任编辑：大汉昆仑王)