胃肠道粘膜T淋巴细胞

 

第四节　胃肠道粘膜T淋巴细胞

一、T淋巴细胞分布及其特点

胃肠道T淋巴细胞分布在上皮层、固有层、粘膜集合和散在淋巴滤泡及肠系膜淋巴结内。随着免疫细胞化学技术广泛应用和各类T细胞亚群单克隆抗体的制备成功，为进一步研究不同部位T淋巴细胞的分类和功能起极其重要的作用。

　　1．上皮内T淋巴细胞上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocyte, IEL）是指位于上皮层基底部的T淋巴细胞。近年来，对IEL对邻近上皮细胞有压迹，位于两个上皮细胞交界处，并未进入上皮细胞内。近年来，对IEL研究非常深入。已经证实75%以上成人小肠IEL是TCRγαβ阳性细胞，说明它们来源于胸腺，接受过抗原刺激。其中大部分为诱导、杀伤性T淋巴细胞（CD ₈ 或OKT ₈ 阳性），10%左右为CD ₇ 阳性和CD ₃ 阴性的IEL，类似NK细胞，有细胞毒作用，但无NK细胞标记，对NK的靶细胞无破坏作用。10%～20%左右为TCRδ阳性IEL，不受胸腺的影响，其中70%CD ₄ 和CD ₈ 均阴性，为T淋巴细胞前体。说明人的部分IEL通过胸腺外途径进行分化。内毒素等腔内抗原与肠上皮细胞微绒毛、肠腺隐窝细胞、巨噬细胞和树突状细胞膜上的组织相关性抗原分子（鼠为MHL-II，人为HLA-DR、HLA-DP和HAL-DR）相结合后，将抗原分子传递到CD ₃ 阳性T淋巴细胞受体（t lymphocyte receptor, TCR）中的α和β亚单位可变区进行结合，在CD ₈ 分子作用下导致IEL增殖和分泌大量γ-干扰素（γ-INF），α-肿瘤坏死因子（α-TNF），和少量的白介素-2（IL-2），发挥细胞毒性作用，调节　上皮细胞再生和增强对食物抗原的耐受。

　　2．固有层T淋巴细胞固有层T淋巴细胞（lamina propria lyphocyte, LPL）分散在固有层，约占固有层免疫细胞总数10%左右。其中CD ₄ 阳性细胞（CD ₄ LPL）显著多于CD ₈ 阳性细胞（CD ₈ LPL）。40%CD ₄ LPL表达CD ₄₅ RO抗原，能产生大量IL-2、IL-4和γ-INF，为记忆性T淋巴细胞，能辅助B细胞转化成抗体产生细胞并促其分泌抗体。60%CD ₄ LPL表达CD ₄₅ RA和CD ₈ 抗原，能直接抑制抗体产生细胞转化和分泌。这两种细胞的比例在调节　抗体分泌中起着重要作用。CD ₈ LPL也可以分两种：一种表达CD ₂₈ 抗原的LPL，能通过ADCC或直接溶解靶细胞。另一种表达CD ₁₆ 抗原，具有自然杀伤功能。LPL能被IL-2激活，激活的LPL能释放大量IL-2、IL-4、γ-INF和IL-5、IL-2又能激活LPL，起着自身分泌作用。IL-5能促进抗体产生细胞分泌抗体。

　　3．胃肠道相关淋巴组织T淋巴细胞胃肠道相关淋巴样组织（gut � associated lymphoid tissue, GALT）主要包括肠系膜淋巴结和粘膜中集合和散在淋巴滤泡。GALTT淋巴细胞多们于生发中心的外周部位，约占40%。其中CD ₈ 和CD ₄ 阳细胞比例与周围血相似。动物研究证明，肠系膜淋巴结内的CD ₄ 阳民生细胞多于固有层。分子生物学研究发现GALTT淋巴细胞含有IL-4和IL-5基因，激活后产生大量IL-4和IL-5，能特异性增加B和T淋巴细胞增殖。抑制B淋巴细胞分化。其表面糖蛋白主要为CD ₄₅ RA和leu ₈ (CD ₈ )，证明是幼稚T淋巴细胞。它们对抗原刺激的增殖反应低，对刀豆素A等有丝分裂促进剂的增殖反应高，产生IL-2和γ-INF低，辅助作用弱。GALTT淋巴细胞如何调节　B淋巴细胞转化成IgA产生细胞和其它免疫细胞的增殖及功能，并不十分清楚。有待进一步研究。

近年研究发现，除M细胞和巨噬细胞外，胃肠上皮细胞在接受和传递抗原中也起重要作用。免疫细胞化学发现正常小肠上皮细胞微绒毛和侧膜有斑片状MHc II类抗原，人小肠为HLA-DR糖蛋白，能识别、加工和传递抗原使粘膜内T淋巴细胞产生免疫反应。HLA-DR表达受γ-IFN诱导。因此免疫反应中组织相关性抗原与IEL和LPL淋巴细胞互相进行调节　。

二、研究方法

1．组织切片中T淋巴细胞80年代以前多用玫瑰花瓣试验和酸性酯酶方法进行组织切片中T淋巴细胞研究，特异性较差。近年来多用OKT，Leu或CD等系列T淋巴细胞单克隆抗体进行研究，特异性高，可以分类出各种亚群。免疫组化染色中应注意以下几个方面：

　　（1）抗体的选择：根据不同目的选择相应的抗体，如要对人胃肠道组织进行研究，可选用OKT系统单抗；对鼠类等进行研究可选用Leu 或Thy系列。如要研究辅助性T淋巴细胞可用OKT ₄ 或CD ₄ ；研究抑制性T淋巴细胞可用OKT ₈ 或CD ₈ 等单克隆抗体。

　　（2）组织加工方法选择：目前所研究的特异性T淋巴细胞抗原决定簇多位于细胞膜上，用陈旧或普通组织固定和加工方法可能使抗原破坏，应采用新鲜组织和低温处理。具体方法是：手术或活检获得的组织立即用液氮冷冻，或用OCT复合物包埋后再放入液氮中，便于切片，Cryostat冰冻切片后室温下风干，用4 ^℃ 纯乙醇或丙酮固定10min，PBS冲洗后即可进行免疫细胞化学染色。

（3）染色方法的选择：因抗原较微量，而且位于细胞膜，应采取敏感性强、特异性高、非特异性着色少的方法。虽然有报道采用间接荧光或间接酶标技术也能显示特异性T淋巴细胞，我们推荐最好采用PAP或ABC染色技术。具体方法参阅第三，四章　。

2．粘膜分离液中T淋巴细胞一定重量粘膜组织中分离出来的T淋巴细胞也可以用免疫细胞化学进行定量和定性研究。下面介绍用间接免疫荧光技术研究IEL的大致过程：

（1）将手术取得的肠管纵形剪开，将上皮层与固有层分离。

（2）上皮层放在无镁离子、含100U青霉素和链霉素及0.2%叠氮纳的PB中清洗，无血液和其它杂质后用解剖剪将组织剪碎，用匀浆器磨碎或用超声粉碎或用胶原酶溶解上皮细胞。

（3）匀浆液通过脱脂棉、尼龙筛（只允许淋巴细胞滤过，除去粘液、碎屑和上皮细胞凝集块）或金属网（200目）获得淋巴细胞悬液。

　　（4）将硅化玻璃球高压消毒，冲洗和平衡后将悬浮液过柱，得到的细胞液直接计数。也可以用淋巴细胞分离液提取，用台盼蓝测定其活性，并加10%FCS-RPMI 细胞培养 液，淋巴细胞数应达5×10 ⁶ /ml。

（5）试管内加0.1ml细胞液后加OKT系列单抗0.1ml，同时用另一试管加0.1mlPBS作对照。混合液在4℃放置30～60min（也可以在冰箱过夜）后，PBS（含RPMI）冲洗3次，离心后细胞沉淀物再加PBS至0.1ml。

（6）加0.1mlFITC标记的抗鼠IgG（根据工作效价），4℃放置20～30min，PBS洗3次，离心后加在红细胞计数板上，荧光显微镜观察。

（7）阳性细胞为细胞膜上有绿色荧光，有的呈颗粒样，随细胞滚动。荧光镜下可计算200个淋巴细胞中阳性细胞所占的百分率，或根据血细胞计数板中阳性细胞算出细胞总数及百分率。

三、临床意义

　　1．IEL在胃肠道粘膜中起重要免疫屏障作用正常成人空肠100个上皮细胞有20个IEL，回肠有13个，结肠只有5个，这也可能是恶性肿瘤不发生在小肠的重要因素之一。我们发现胃粘膜也有IEL。在胃部炎症和溃疡时，上皮及腺体隐窝细胞间的IEL明显增加。IEL不但参与免疫反应，而且通过伪足与上皮细胞接触，加速上皮细胞再生。电镜下胃粘膜也发现这种现象。IEL与乳糜泻（coeliac disease, CD）关系最密切。近期研究表明，第12型腺病毒与麦胶蛋白有同源性。CD病人肠道感染这种病毒后，服用麦胶数小时粘膜中IEL显著增加。在上皮细胞HLAII抗原糖蛋白分子作用下与TCR结合，激活TCRαβlEL，发挥细胞毒作用，导致肠粘膜萎缩，引起脂肪吸收不良和腹泻等一系列临床症状。增加的TCRγδIEL调节　TCRαβ的杀伤作用。停服含麦胶食物后，TCRαβIEL明显减少，上皮细胞再生恢复，临床症状消失。CD病人出现疣状胃炎也是IEL参与的免疫反应结果。CD病人的肠道淋巴瘤也是来自IEL增殖。器官移植后的宿主排异反应、结肠炎、热带性腹泻、牛奶过敏和某些 自身免疫 性疾病均有IEL增加。也有人发现克隆氏病和溃疡性结肠炎患者结肠IEL细胞毒性作用明显减弱。当然，IEL增加是继发或是原发，是否IEL是这些疾病的病因，临床治疗和诊断价值如何，还不清楚。而且IEL受年龄、抗原、免疫调节　剂（考的松对IEL无影响，环磷酰胺显著降低IEL数量）等因素影响，因此需要深入进行研究。

2．粘膜固有层T淋巴细胞在局部体液免疫中起重要调节　作用在GALT中有开关性T淋巴细胞使生发中心的淋巴母细胞转化成IgA产生细胞。这些细胞减少或功能缺乏可导致免疫球蛋白A缺乏。有人分离出克隆氏病和溃疡性结肠炎病人固有层T淋巴细胞进行研究，发现辅助性T淋巴细胞减少，抑制性T淋巴细胞显著增加，可能导致局部免疫失调，引起细胞毒性或迟发性过敏反应等，致使炎症和溃疡发生。

3．胃肠道肿瘤细胞中T淋巴细胞研究倍受重视我们及国内外一些报道均证明胃癌组织中T淋巴细胞显著增加，且其细胞毒性大于非癌组织。胃癌病人周围血T淋巴细胞毒性低于粘膜T淋巴细胞。但有人发现胃癌组织中T淋巴细胞的ADCC作用较弱。