基因治病的靶向

 

　　基因治疗中的靶向问题是基因治疗中急待解决的问题。逆转录病毒 载体 是目前治疗中应用较为广泛且效果较好的 载体 。有关逆转录病毒靶向的研究已取得一些进展，使得基因治疗更为安全和有效。

（一）逆转录病毒转导的细胞类型的选择调节

Mo-HLV是一个可广泛转导多种细胞的病毒，为了使其仅感染某些专一性细胞就必须改变其感染谱。

1、改变Mo-HLV感染谱

按宿主范围可将Mo-HLV分为三类：单向性：只能感染啮齿类细胞；异向性：可感染除啮齿类动物细胞以外的其它的细胞；双向性：可感染人及啮齿类动物等大多数细胞。感染细胞的类型是由病毒的外壳蛋白env确定的。

　　（1）病毒与抗体的偶联：为了使逆转录病毒定向感染所需要的靶细胞，可将病毒与抗体偶联，该抗体则针对所需感染细胞上特有的抗原。如使单向感染病毒与抗人MHC-1。MHC-II的抗体偶联或与抗人表皮生长因子的抗体偶联后，可以感染人类细胞。Goud等使用此法使单向病毒感染人的肝细胞，可惜病毒未能整合入肝细胞 基因组 ，可能其中还有其它原因。

（2）病毒外壳蛋白与配体偶联：　如将env蛋白与乳糖偶联成去延酸糖蛋白，用此法改造的单向逆转录病毒将不再感染原先的宿主而只感染人的肝细胞，因为只有肝细胞表面上含有去延酸糖蛋白的受体。

（3）改变病毒外壳蛋白的识别序列：已发现env蛋白与被感染细胞受体相识别部位的化学组成，如果改变核表位的基因序列，就可能改变感染细胞的类型，但Etienne等认为有一个潜在的、非病毒原有的表位与细胞受体识别之后不能使病毒内化。一种可行的方法是同时表达原有的env蛋白，就能解决内化问题。

　　2、使用其它逆转录病毒 载体 ：

　　牛 白血病 逆转录病毒，猿免疫缺陷病毒，鼠乳腺肿瘤病毒有组织专一性感染的特点，有些研究组利用其作为载体。Page等采用HIV作为病毒载体，Rizvi等用BLV作载体，Morris等采用MMTV作载体，并构建了MMTV独特的包装细胞，使病毒滴度提高百倍以上，但同Mo-MLV相比，其它病毒的滴度偏低。

3、以嵌合逆转录病毒为载体

逆转录病毒感染谱是由病毒颗粒决定的，如果我们改变病毒颗粒蛋白，即保留毒gagpol基因，而env基因来自另一个逆转录病毒，即可改变感染宿主范围。Laudau等用鸟逆转录病毒和RSV的env基因取代Mo-MLVR env基因，Miller等用长臂猿白血病病毒的env基因嵌合Mo-MLVR成功感染了多种细胞，并取得较高的滴度，Gong等用流感病毒的血凝素取代RSV的env基因蛋白，将血凝素成功地嵌入病毒外壳，并能有效感染人和鸟类细胞。Jane等用泡状口炎病毒G糖蛋白取代莫洛尼病毒env蛋白，使该病毒颗粒能成功地感染非哺乳动物如Zebra fish细胞，更重要的是这种病毒外壳可耐受超离心而不影响感染效率，因此有利于浓缩病毒，提高滴度。

（二）目的基因组织专一性表达的调节

许多组织专一性表达的调节片段已研究清楚，把这些片段与目的基因一起重组入逆转录病毒可用于基因的靶向表达。

1、肝专一性表达

　　肝专一性表达研究较多的是磷酸烯醇式酮酸羧激酶的启动子。McGrane 等用了 转基因动物 技术使该启动子表达外源基因，证明该启动子专一性地在肝和肾等中表达；Hatzoglau等用PEPCK启动子与neo基因或牛生长因子重组入逆转录病毒载体。克隆后经腹腔注射入子宫感染鼠胎肝或注入门静脉并切除部分肝，证实前病毒可整合肝细胞基因组，并持续表达了八个月之久，而且牛生长因子表达量受食物刺激信号的调节。

另一个肝专一性表达的片段是A-胰蛋白酶基因的顺式作用因子。Simon等的研究表明，α-AT基因上游是决定肝专一性表达的片段，（-137～37）为最短的肝专一性表达的片段。Peng等用α-AT的（-730-30）片段与SV40启动子融合驱动人苯丙氨酸羟化酶基因，使其在肝脏专一性表达，为苯丙酮尿症基因治疗奠定了基础。

α-FP为肝癌细胞特有的高效表达产物，Watanabe等发现其上游调控区（-3700～3300）决定了α-FP在肝癌中的专一性表达。Huber等将片段与你腺嘧啶激酶基因融合，克隆入逆转录病毒后转染肝细胞，然后给予无毒性原药-阿拉伯糖核苷，只有肝癌细胞才专一性地合成TK，批ara-MF转化成细胞毒性ara-ATP，造成肝癌细胞的死亡，而其它感染了α-EF-TK的细胞不受影响。

2、肌肉专一性表达

肌肉中高效表达的是肌苷激酶的调控片段。Johnson等发现MCK调控区有两个增强子：一个位于（-1256～1049），决定肌肉和心肌专一性表达，另一个位于第一内含子（738～1599），只决定在心肌的高效专一性表达。Cox等用这两个增强子使Dystrophin在肌肉的表达量增强50倍，完全纠正了mdr鼠肌肉病理变化，而且无付作用，最近，Yao等用2分MCK增强子（-1350～1048）使人凝血因子IX在肌母细胞中得到高效表达。

3、乳腺专一性表达

在乳腺中专一性表达的基因有β酪蛋白，乳清酸蛋白，鼠乳腺肿瘤病毒，三都调控区中的负调控片段决定他们仅在乳腺组织中表达。

4、黑色素瘤专一性表达

黑色素瘤特异性表达酪氨酸和酪氨酸相关蛋白。决定酪氨酸专一性表达的片段是在该基因上游（-270～1），决定TRP-1专一性表达的区域为（-640～165），Hart等用上述调控区与Gal报告基因融合，在人与鼠的黑色素瘤细胞中均检测到其表达。

5、胶质瘤专一性表达

目前已知鞘磷酸碱性蛋白基因上游（-1300～1）片段决定其在胶质瘤细胞中的专一性表达，Miyao等用该片段与HTK基因融合，转染胶质瘤细胞，在1μMganciclovir培养液中，90%胶质瘤细胞死亡，而对照组生长不受影响。

6、肺癌专一性表达

　　人表面活性蛋白A是大多数肺癌表达的物质。Smith 等用SPA-1上游（-2600～178）片段驱动HSV-TK基因，转化肺癌 细胞株 H441，给予ganciclovir后，H441大量死亡。