使用靶向定向细菌体噬菌体将基因转移至哺乳动物细胞内

使用靶向定向细菌体噬菌体将基因转移至哺乳动物细胞内

材料

试剂

β-半乳糖苷酶

喜树碱(l 〇 m m o l /L ) (Sigma-Aldrich C 9911) 的二甲亚砜（D M S O ) 溶液 —20°C 保存。

细胞培养基： R P M I 1640 + 1 0 % 胎 牛 血 清（F B S )， O.l m m o l /L 非必需氨基酸，l m m o l / L 丙酮酸钠， 2m m o l / L L -谷氨酰胺和 S O p g / m l 庆大霉素

D N a s e I ( G I B B O 18068-015)

E D T A (0•5m o l /L )

固定缓冲液（含 0.925% 甲醛， 0.02% 叠氮化钠 和 葡 萄 糖 的 p B S ，p H 7. 4)

甘 油（2 0 % )

铲宿主菌株（Stratagene 200249 X L l -B l u e 感受态细胞）

经 基 脲（l. 〇 m o l /L ) < ! > (Sigma-Aldrich H 8 6 2 7 ) 的 P B S 溶 液- 2 0 ℃保 存

L B 培养基平板（1 % 胰蛋白胨， 0 . 5 % 酵母提取物， 0.5% N a C l ， P H 7.0 和 2 % 琼脂）

L B + 培养基平板（1 % 胰蛋白胨， 0 . 5 % 酵母提取物， 0 . 5 % N a C l ， pH7.0, 2 % 琼脂 和 60ug/m l 氨苄青霉素

M g C l 2 (l m o l / L )

P C -3 细 胞 系（N C I 细胞库）和 H T 1229 (A T C C )

磷酸盐缓冲液（P B S )

P B S + A E B S F (0• 2m m o l /L ) (4- [2-氨 乙 基 ] 苯 磺 酰 氟 ）（R o c h e 1585916)

复 制 式 M 1 3 噬 菌 体 D N A

S O C 培 养 基（G I B C O 15544-034)

氯 化 钠（N a C l ， I.5m o l /L ) / 3 0 % 聚 乙 二 醇（P E G ) 8000

含 报 道 基 因 G F P 的 靶 向 噬 菌 体 颗 粒

Triton X -114 ( 1 0 % )

胰 蛋 白 酶（0 . 2 5 % ) ( G I B C O 25200-056)

紫 外 辐 射（Stratalinker 紫 外 交 联 仪 ， Stratagene)
2 X Y T 肉汤培养基（1.6% 胰蛋白胨， 0 . 5 % 酵母提取物， 0 . 5 % N a C l , p H 7.0 和60ug /m l 氨苄青霉素

仪 器

离心瓶

冷冻管
F A C S /带有荧光素异硫氰酸酯（F I T C ) 过滤设备的流式细胞仪

37°C 和 42°C 培养箱

微 离 心 管（Eppendorf)

微量移液器

振荡摇床

注射器过滤器（0. 45um )

注射器

组织培养盘（12 孔）

管 子（无 菌 ， Falcon 2059)

55°C 水 浴 锅

方法

D N a s e I ( G I B B O 18068-015)

E D T A (0•5m o l /L )

固定缓冲液（含 0.925% 甲醛 ， 0.02% 叠氮化钠 和 葡 萄 糖 的 p B S ，p H 7. 4)

甘 油（2 0 % )

铲宿主菌株（Stratagene 200249 X L l -B l u e 感受态细胞）

经 基 脲（l. 〇 m o l /L ) (Sigma-Aldrich H 8 6 2 7 ) 的 P B S 溶 液

• 2 0 ℃保 存

• L B 培养基平板（1 % 胰蛋白胨， 0 . 5 % 酵母提取物， 0.5% N a C l ， P H 7.0 和 2 % 琼脂）

  L B + 培养基平板（1 % 胰蛋白胨， 0 . 5 % 酵母提取物， 0 . 5 % N a C l ， pH7.0, 2 % 琼脂 和 60M g/m l 氨苄青霉素）

  M g C l 2 (l m o l / L )

  P C -3 细 胞 系（N C I 细胞库）和 H T 1229 (A T C C )

  磷酸盐缓冲液（P B S )

  P B S + A E B S F (0• 2m m o l /L ) (4- [2-氨 乙 基 ] 苯 磺 酰 氟）（R o c h e 1585916)

  复 制 式 M 1 3 噬 菌 体 D N A

  S O C 培 养 基（G I B C O 15544-034)

  氯 化 钠（N a C l ， I.5m o l /L ) / 3 0 % 聚 乙 二 醇（P E G ) 8000

  含 报 道 基 因 G F P 的 靶 向 噬 菌 体 颗 粒

  Triton X -114 ( 1 0 % )

  胰 蛋 白 酶（0 . 2 5 % )( G I B C O 25200-056)

  紫 外 辐 射 （Stratalinker 紫 外 交 联 仪 ， Stratagene)

  2 X Y T 肉汤培养基（1.6% 胰蛋白胨， 0 . 5 % 酵母提取物， 0 . 5 % N a C l , p H 7.0 和60ug /m l 氨苄青霉素)

  仪 器

  离心瓶

  冷冻管

  F A C S /带有荧光素异硫氰酸酯（F I T C ) 过滤设备的流式细胞仪

  37°C 和 42°C 培养箱

  微 离 心 管（Eppendorf)

  微量移液器

  振荡摇床

  注射器过滤器（0. 45(um )

  注射器

  组织培养盘（12 孔）

  管 子（无 菌 ， Falcon 2059)

  55°C 水 浴 锅

  方法

  细菌的转化

  使用标准的分子生物学技术，将改造后含有哺乳动物表达盒的复制式重组噬菌体载体转化宿主细菌。在我们的研究中，使用了商业来源的 C M V 启动子和生长激素（G H )多聚腺苷酸 D N A 。

  1.在冰上融化 IOO m I 感受态细胞。

  2 .在细胞悬液中加入 I.7m1 p-半乳糖苷酶，冰上孵育 l O m i n 。

  3.将 50n g 的复制式噬菌体 D N A 与细胞混合后，冰上孵育 30m i n 。

  4.42°C 热激细菌 45s，将细菌置于冰上 2m i n 。

  5.将 900M S O C 培养基加入细胞， 37°C ， 250r/m i n 振荡培养 l h 。

  6•将细胞涂布 L B + 培养平板， 37°C 培养过夜。

  靶向噬菌体颗粒的制备

  使用标准的噬菌体展示技术，将所需的配体改造在 gill 上 ，从而最终的颗粒将展示可以将噬菌体耙向到哺乳动物细胞上的配体-p i n 融合体。

  7.用 含 6ug /m l 氨苄青霉素的 2X Y T 培养基培养嗟菌体转化的细菌， 3r C ， 300r/m in振荡培养细菌过夜。

  8.4°C ， 6000 g 离心细菌培养物 l O m i n。

  9•保留上清，加 入 1/5 体积预冷的 1.5m o l /L N a C l /30% P E G 。混合均勻，冰上培育2 h 使噬菌体沉淀。

  10.4°C ， 15 OOOg■离心 30m i n 收集噬菌体，除去上清和并吸干所有残留的液体。

  11.用 含 0 •2m m o l / L A E B S F 的 P B S 溶液重悬噬菌体， 4°C 放 置 30m i n 。

  12.20 OOOg■离心 20〜30m i n 以除去残瘡。

  13•如果需要进一步浓缩噬菌体，重复步骤 9〜11。

  14.加入 M g C l z 至终浓度 lO^m o l /L ，每毫升噬菌体溶液加人 6 单位的 D N a s e I。室温下放置 20m i n ，以每毫升噬菌体溶液加人 IOuI 〇.5m o l / L E D T A 终止反应。

  15•立即加人 1/5 体积预冷的 1.5m o l/L N a C l / 3 0 % P E G 。混合均勻，冰上放^ 2 h 使睡菌体沉淀。

  16.4°C ， 15 O O O g 离 心 30m i n 收集噬菌体，除去上清和并吸干所有残留的液体。

  17.用 含 0. 2m m 〇 I/L A E B S F 的 P B S 溶液重悬噬菌体， 37°C 放 置 5 〜 1 5 m i n ^ 代 静置 30m i n o

  18.20 000 尽离心 20〜30m i n 以除去残渣。

  19.用 0.45um 滤器过滤噬菌体， 2 0 % 甘油冷冻，一 70℃保存。

  Triton X -IM 相分离除去内毒素

  在任何细胞和动物研究之前除去内毒素很关键。

  2 〇 •每毫升样品加人 1(%1 10% Triton X-m ，冰 上 放 置 30m i n , 偶尔振荡一下。 37°C放 置 IOmin0

  21•室温下 14 000r/m i n 离 心 lOmin，保 留 水 相（上层)。

  22.重复相分离（步骤 2 0 和 2 1 ) 两次。

  滴 度 噬 菌 体 用 噬 菌 斑 形 成 单 位 来 确 定 产 量

  23.37°C 预 热 L B 培养平板，融化上层的琼脂（L B ) , 并放入 55°C 水浴锅中。

  24•将 F ‘细菌培养至〇 D s。。=0. 5，取 3(%1 细胞至每个待测的 Falcon 2059 管中。

  25•用 P B S 进行梯度稀释，起始稀释度为 1 〇〇倍（5^1 稀释至 500^1 P B S 中），每个稀释度重复数次。从每个稀释度管中去 IOOuI 加人细菌细胞中。

  26.每个管中加人 3m l 琼脂，混匀后倒人预热的 L B 平板上层，使上层琼脂凝固，然后37°C 反置过夜。

  27.4 十数噬菌斑并且将噬菌斑数、稀释倍数和倒板体积相乘确定滴度（pfu/m l)。

  培养细胞的转导

  28•将 I m l 细胞培养物接种 12 孔组织培养盘， 5 % C O 2 温箱中 37°C 培养过夜。

  通过细胞的生长速度确定种板密度。培养过夜后， 12 孔盘中细胞的汇合度应该达到 25%,我们接种 PC-3 细胞的密度是 2XIO4 个细胞/孔。

  29.弃去细胞培养基并用含有噬菌体的培养基替代。最高转导效率的靶向噬菌体的典型剂量是 IO¹¹P f u A n L 5 % CO2 温箱中 37°C 培养 24〜96 h 。如果使用了遗传毒性处理，则培养 40 h 。

  30.除去含噬菌体的细胞培养基，并 用 P B S 洗涤以收集细胞用于报道基因分析。加入150ul 胰酶， 37°C 放 置 2〜3m i n 使细胞脱离培养盘。立 即加人 350M 1 固定缓冲液。用 有 F I T C 过滤器的流式细胞仪分析细胞。

  遗传毒性处理

  嗟菌体被加入培养物中， 40 h 后开始遗传毒性处理。对每个目的细胞系都应该优化处理的条件。

  31.对于热激和 U V 辐射，需要制备含 1 0 % 胎牛血清的细胞培养基。反之，则需要加人1〜l O O um o l /L 喜树减或10— 100m m o l /L 轻基脈。

  32.除去含噬菌体的培养基。用以上的遗传毒性培养基代替，或用含 1 0% F B S 的培养基用于热激或 U V 辐射。

  33.直 接 37°C 或 42°C (热激）或 辐 射 （100〜lOOJ/m 2) 培 养 7 h 。

  34.P B S 洗 涤 3 次。

  35.加人含 10% F B S 的新鲜培养基。 37°C 培 养 24〜48 h 。

  36.P B S 洗 涤 3 次 ，通过直接观察 G F P 或 F A C S 分析来检测遗传毒性处理效果。