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昆虫病原细菌、真菌的分离及病毒的提纯

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一、目的要求:
昆虫病原体的采集,整理是研究昆虫病理和利用微 生物 进行害虫防治的第一步。识别症状是诊断学的主要内容。本实验要求对昆虫疾病有一个较直观的了解,从而为今后工作打下基础。

二、实验内容:
1. 病体材料的收集
因病死亡的昆虫,可发现于植物的枝叶、茎内、花苞。果实中地表土下等,样本多数脆弱。因此,采集时应以单个样本连同基物的一部份或全部置于小瓶中,并加棉塞。
已收集到的病、死虫体,应迅速处理,进行检查,鉴定和分离病原,并没有进行寄主病情的描述,进行编号和记载,也要考虑到病理组织学的研究和回接试验所用。因此,要有一定的标本数量。同时,有必要对采到的材料进行暂时保存。冷藏可进一步阻止样本进一步腐解,可将病虫死体置于冰箱保存。
2. 样本的症状识别:
⑴ 细菌病的一般特征:感病昆虫活动力减退,食欲减退,食量大减,口腔、肛门常有吐泻排泻物,多数因败血症而死亡。死虫躺卧在植物或其他物质表面,或侧挂于枝叶。体色多加深至黑色或红色。内部组织崩溃粘液态,有时发臭。
⑵真菌病的一般特征:死虫笔直僵硬,体表多覆盖有菌丝或孢子,呈现白色、黄色、红色、褐色或绿色、黑色等。体脆,受压易碎裂。
⑶病毒病的一般特征:类似于细菌,但无上吐下泻现象。死虫常倒挂或平卧于植物上。虫体柔软,表皮一触即破。内部组织液化。
3. 观察下列标本:
⑴ 细菌病:菜青虫、小菜蛾、柑桔凤蝶。
⑵真菌病:虫霉:桃蚜、蝉、蝇。
冬虫夏草
白僵:松毛、象虫、稻纵卷时螟、瓢虫
绿僵:菜青虫
菜氏蛾霉:柑桔粉虱
轮枝:蚜虫
青霉:荔枝
拟青霉:柑桔卷叶蛾
⑶病毒病:NPV:8305、棉铃虫、松毛虫。舞毒蛾
GV:菜青虫、小菜蛾、东方粉蛾
⑷线虫:DD—136

三、目的要求:
为了获得昆虫病原微 生物 ,为鉴定、分类等到的研究和生产应用,首先就必需对罹病昆虫进行分离筛选,对它们的杀虫能力和其他特性进行比较鉴定。最后选出毒力高、性能优良的品系供防治害虫用。
四、实验材料:
解剖皿 75%酒精
剪刀 0-1%升汞
镊子 无菌水
接种环 磷酸缓冲液(PBS)
培养皿
天平
离心机
滤纸
五、实验内容:
1.病原细菌的分离:把罹病昆虫放入75%酒精中浸泡0.5分钟然后放在0.1%升汞中消毒0.5~1分钟,再以灭菌洗3次。表面消毒后放入解剖皿,解剖皿的表面石蜡须以75%酒精洗擦消毒,并掠过火焰。虫体从背面或腹面进行纵向解剖。所有器械事先均须消毒。注意不能使肠壁破裂。血液可体液取出,用无菌水稀释,每培养皿装入2ml左右无菌水,共用3个培养皿,从第1皿中用接种环移入3环至第2皿,再从第2皿移入3环至第3皿,最后倒入冷却至40-50。C的细菌培养基,放入30。C温箱培养。一天后进行菌落观察,并用划线阖进行纯化。纯化后的细菌转入斜面培养并置于冰箱保存。
2.病原真菌的分离:被真菌侵染的虫体,可以用灭菌的镊子,或接种针,直接从体表挑取菌丝或孢子而移接于适宜的真菌培养革上培养。应同时进行体表和内部真菌的分离,检验是否为同一 菌种 。在25。C左右培养。由于真菌一般比细菌生长慢,有时为了控制细菌污染,可在培养基中加入少量的抗菌素。
3.昆虫病毒的提纯:病毒、立克次氏体,原生动物和多数线虫不像真菌和细菌那样奶在人工培养基上培养。针对昆虫病毒,主要是进行提纯,以供鉴定,分类等研究之用。
⑴低速差异离心法:将病虫称重后捣碎,以1:40比例,即1克虫体加40ml磷酸缓冲液(PBS),过滤去渣,滤液以500转/分离心15分钟,除去组织碎片杂质(沉渣),上清液再以4000转/分离心2小时,弃去上清液,取沉淀。如此可反复几次。用 滤纸 吸干再冰冻干燥。
⑵ 丙酮一乳糖共沉法:怪病虫称重后捣碎,以1:40PBS稀释,尼龙纱过滤,滤液经1500~2000转/分离心2小时,弃上清液,按1:10加5%乳糖溶液,充分搅拌后,缓缓加入4倍量丙酮,边加边搅拌30分钟,静置10分钟,3500转/分离心20分钟。将沉淀物缓缓加入适量丙酮,边加边搅拌30分钟,再离心,如此重复3次即可得到灰白色粉状病毒,经冷却干燥,称重,于冰箱中保存。
此外,还有蔗糖梯度分离法和分子筛胶层析法。

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