成人骨髓基质细胞体外培养及鉴定

 

王振斌1 艾合麦提·玉素甫1 邹林樾2 刘大鹏1
新医大一附院 1骨科专科医院创二科；2 中心实验室，乌鲁木齐 830054

关键词：骨髓基质细胞 细胞培养 成骨细胞

骨髓是一个具有多种细胞成分的复杂器官，有造血及成骨能力。骨髓细胞的成骨能力来源于骨髓基质系统的基质干细胞,在体外，骨髓基质细胞的成骨作用已得到肯定[1]。由于骨髓具有取材方便、对机体损伤小的特点，成为骨组织工程最有应用前景的种子细胞。但骨髓基质细胞具有多分化潜能，且有多种成分，因此，骨髓基质细胞的纯化和对其定向诱导分化为成骨细胞，是其应用于骨组织工程的前提。本实验是在动物实验的基础上，探讨一种通过换液纯化骨髓基质细胞，使用条件培养基使其定向分化的方法，旨在建立一种简便易行的体外培养方法，为进一步研究成骨细胞及骨组织工程提供技术平台。

1 材料与方法
1. 1 材料来源
6例健康志愿者,16～51岁，（其中女性2名，男性4名）行全髋关节置换术时抽取股骨骨髓。 实验中所用的ＤＭＥＭ(美国Gibco公司,经过滤除菌处理); 胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,经灭活后使用);地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素Ｃ和胰蛋白酶(Sigma公司)。倒置相差显微镜（日本，Olympus）;CO ₂ 孵箱（德国，Heraeus）;透射电镜(JEM 100CXⅡ)
1.2 细胞培养
注射器肝素化(200U/ml肝素1ml)后抽取3～5ml骨髓置入装有ＤＭＥＭ培养液的无菌50ml离心管内,带至实验室。（1）原代培养：将所获得的健康成人骨髓3～5ml,100目钢网过滤后,平头吸管反复抽吸吹打制成单细胞悬液,采用全骨髓培养法以1×10 ⁶ /ml置于50ml培养瓶中培养,每瓶含10ml培养液(含青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml,15%胎牛血清,普通低糖DMEM),置于37℃、5%CO ₂ 湿化空气的孵箱中进行原代培养。48ｈ后半量换液,以后每48～72ｈ全量换液。（2）传代培养：原代培养至第10～12ｄ,细胞汇合成单层,用无血清DMEM洗涤,0 25%的胰蛋白酶加0.02%EDTA(1∶1)混合消化细胞,在倒置显微镜下观察至细胞分离、脱壁(约1～2min,依胰蛋白酶作用的温度与放置时间而异)后,加入完全培养液终止消化。收集消化所得的细胞悬液至离心管中,以1000ｒ/min离心10min,弃上清液,加完全培养液将细胞重新悬浮并混合均匀,计数后,以5×10 ⁴ /ml接种到培养瓶、24孔板及预先放置盖玻片的6孔培养板中传代培养。将传代细胞分为两组,1组仍采用完全培养液;2组使用条件培养基(DMEM完全培养液中加入10 ^-8 mol/l地塞米松、10mmol/lβ-甘油磷酸钠、50mg/l维生素Ｃ)。两组细胞持续培养,常规2～3ｄ换液1次,进行细胞形态学观察及生物学特性检测。
1.3 形态学观察
（1）相差显微镜观察。原代及传代培养的细胞,用倒置相差显微镜逐日观察细胞生长、增殖情况及形态特征并照相。（2）组织学观察。将传代培养长有细胞的盖玻片取出,PBS洗涤,用冷酒精或丙酮固定,HE染色,光镜下进行组织学观察。（3）透射电镜观察。将长有细胞的盖玻片取出,进行细胞消化,戊二醛前固定,四氧化锇后固定、丙酮脱水,环氧丙烷置换,树脂浸透,经包埋、聚合后超薄切片,铀、铅染色,透射电镜观察。
1 .4　生物学特性检测
(1)绘制细胞生长曲线：取生长良好的第二代细胞，以5×10 ⁴ /ml密度接种于24孔培养板中，置于37℃CO ₂ 孵箱中培养。每天取3孔，连续取8次，以胰蛋白酶-EDTA消化后，离心2min（1 000r/min）。细胞密度计数，取3孔的平均值。以细胞密度为纵坐标，绘制细胞生长曲线。(2) 碱性磷酸酶染色：传代培养细胞长满后,胰酶消化,制备细胞悬液,以5×10 ⁴ /ml细胞接种于放有盖玻片的6孔板内,培养3ｄ后取出玻片,PBS冲洗后,丙酮固定,采用改良Gomori钙钴法检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)的活性。染色后胞浆内ALP显示灰色、棕色或黑色，即为阳性。阳性细胞计数方法:每张盖玻片随机计数100个细胞,计算ALP阳性细胞的百分比。(3)细胞形成钙结节能力检测:在条件培养基中连续培养至镜下可观察到钙结节形态，然后采用Von-kossa’s染色，出现黑色沉着物为阳性。

2 结 果
2.1 形态学观察
2.1.1 相差显微镜观察 （1）原代培养:倒置相差显微镜下,刚接种的骨髓中含有大量红细胞，几乎不能观察到细胞的贴壁，48ｈ～72h可以观察到在红色的细胞层间出现散在的小裂隙。换液后证实：这些裂隙为少数贴壁细胞，呈成纤维细胞样外形,以后细胞呈克隆生长。随换液次数的增多，造血细胞被逐渐清除。原代培养4～5天,贴壁细胞开始增殖并向三角形、多角形、梭形等分化,表面颗粒少。6～8天后,部分区域形成细胞团簇,细胞呈现成纤维细胞梭形外观,有较多突起,胞核明显,呈卵圆形,可见1～3个核仁,胞质丰富、清晰。细胞分裂相多见。10～14天长满瓶底。（2）代传培养:传代培养时3～4ｈ开始贴壁,6～8ｈ贴壁完全,并向梭形细胞、多角形细胞转化,有数个突起,突起的个数及形态各不相同。使用条件培养基传代培养5～7天后细胞融合成单层,随着培养时间的延长,某些局部细胞可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象,重叠生长的细胞逐渐形成结节状。随后胶原堆积及钙盐沉积,最后形成不透光矿化结节。在传代培养中将条件培养基改为完全培养基,则细胞间出现接触抑制,没有重叠生长。连续传代培养六代以上的细胞可见胞体增大,胞质稀薄,部分区域出现空泡,细胞核分裂相少见等退行性改变。
2.1.2 组织学观察 ＨＥ染色后光镜下观察,培养的骨髓基质细胞呈梭形、多角形,有多个大小不一、长短不均、互相连接的突起,胞浆淡蓝色,含有较大的颗粒,核卵圆形,可见数个深蓝色的核仁,染色质疏松,细胞分裂相多见。
2.1.3 透射电镜观察 见细胞胞质丰富, 各种细胞器成熟,线粒体、高尔基体、粗面内质网、核糖体较多,有丰富的颗粒状电子致密物, 核大, 常偏于一侧, 可见1～2 个核仁, 染色质丰富, 呈团簇样分布。
2.2 细胞生长曲线
由细胞生长曲线可以看出，细胞从传代后第1d，细胞数量即开始增加，第3天增加幅度最大，至第6d细胞数量最大，以后数量略有下降。说明潜伏期小于24h，传代培养对数增殖期为2～4d，对数增殖期结束后，第6天细胞生长缓慢，进入平台期。