血细胞计数及大小测量

一、 目的与要求
1. 掌握用血球计数板进行细胞直接镜检计数的方法。
2. 学习测量细胞大小的方法。
二、 实验原理
动物组织细胞的体外培养、血液中血细胞数量的变动、许多产品的细菌学检查、微 生物 培养等科研、生产和临床上常常需要检测细胞的数量。测定细胞数量的方法有很多种，其中，用血细胞计数板于显微镜下直接计数的方法样品用量少，操作简便、快速、直观，是一种较常用的细胞计数方法。
血细胞计数板由一块长约7.5cm、宽3.5cm的厚玻璃制成，在中部1/3面积处有4条槽，内侧两条槽之间还有1条横槽相通，在中部构成2块长方形平台。此平台比整个载玻片平面低0.1mm。平台中部各有一个计数室，每个计数室分九大格，每格边长1mm，面积为1mm2，盖上盖玻片后体积为0.1mm3。四角的大格被划分为16个中方格，一般用作白细胞、血小板及组织培养的细胞计数。中央的大方格则由双线划分为25个中方格，每个中方格面积为0.04mm2，盖上盖玻片后体积为0.004mm3，每个中方格又分成16个小方格，用于红细胞、微 生物 细胞的计数。
细胞的大小和形态依细胞种类不同各异，通常血细胞呈椭圆形或圆球形，直径在10?m左右，按公式V＝4/3?ab2（a为长半径，b为短半径）可求出细胞体积。因此，测量细胞体积首先要用测微尺测出细胞的长半径和短半径。
常用的测微尺有目镜测微尺和物镜测微尺两种。目镜测微尺为一块圆形的薄玻璃片，直径20－21mm，正好能放入目镜的镜筒内，其上面刻有不同形式的标尺。标尺有直线式和网格式两种，直线式又分为“十”字形和“一”字形两种。直线式测微尺总长10mm，分为10大格，其上有数字指示，每一大格又分10小格，共100小格。网格式测微尺常用来测量面积或计数。
物镜测微尺是一种特制的载玻片，其中央有一个圆圈，圈内具有一个有刻度的标尺，为直线式标尺，全长1mm，分为10大格，每大格又分10小格，共100小格。每小格长度为0.01mm，即10?m。
由于目镜测微尺刻度的长度随物镜放大倍数不同而有改变，所以用目镜测微尺测量细胞前，首先要测定目镜测微尺的长度，即使用物镜测微尺来确定目镜测微尺刻度的长度，然后再以目镜测微尺上的刻度作为测量细胞时的度量单位。
三、 材料和用具
显微镜、载玻片、盖玻片、血球计数板、采血针、干消毒棉球、移液器、 试管 、滴管、目镜测微尺、物镜测微尺、计数器。
75％乙醇、红细胞稀释液、白细胞稀释液。
四、 操作与观察
（一） 血细胞计数
1. 用1mL移液器准确吸取0.38mL白细胞稀释液放入一支干净的小 试管 内，加塞备用。用5mL 移液器 准确吸取3.98mL红细胞稀释液，放入一支干净的中试管内，加塞备用。
2. 用消毒棉球蘸75％乙醇消毒左手无名指或耳垂边缘，待酒精挥发后用采血针刺入皮肤2-3mm深，让血液自然流出。（注意：必须待酒精挥发后用才能采血，否则流出的血液不成滴，无法吸取。）用干消毒棉球拭去第1滴血液，待第2滴血液成大滴时，用 移液器 吸20?l血,再将移液器内的血趁出血处尚有血液流出，换1个枪头用移液器吸取20?l血液放入盛有红细胞稀释液的试管底部。轻轻摇振试管1－2min，混匀稀释的血液，但不可用力过猛，以免产生泡沫。
3. 充液：用擦镜纸将计数板擦干净，盖上盖玻片。用移液器吸取20?l稀释的血液，滴在计数板上盖玻片的边缘，使其依靠毛细现象自动流入计数室内。一般应一次充液使计数室内充满稀释血液，若经几次充液，易形成气泡，应洗净计数板和盖玻片，干燥后重新充液。红细胞和白细胞应分两次充液。
4. 计数：为防止重复计数和漏数，计数时应遵循一定的顺序，对正好压在格线上的细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数。如果计数白细胞时发现各大方格的白细胞相差8个以上或计数红细胞时发现各中方格的红细胞相差20个以上，表明血细胞分布不均匀，须将稀释的血液摇匀后再重新充入计数室计数。