细胞组分的化学反应实验

【实验目的】
了解核酸、蛋白质、糖及酶的细胞化学反应原理，掌握Brachet反应及碱性蛋白、酸性蛋白、糖原和过氧化物酶的细胞化学染色方法。
【实验用品】
一、材料和标本 蟾蜍、小白鼠各一只、肝脏石腊切片、培养的Hela细胞。
二、器材和 仪器 光学显微镜、解剖器材、蜡盘、载玻片、吸水纸、染色缸、盖玻片、水浴箱。
三、 试剂 PBS缓冲液(pH7.2)、甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液、纯丙酮、l/2丙酮+1/2二甲苯、纯二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％碱性固绿、0.1％酸性固绿、0.5％硫酸铜、联苯胺混合液、1％番红、无水乙醇、过碘酸酒精液、Schiff氏酒精液、亚硫酸水、Ehrlieh苏木精、95％乙醇、Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，体积比)
【实验内容】
细胞的组织化学方法，是研究细胞成分常用的方法之一。它是利用化学 试剂 与细胞内的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的 生物 化学成分进行定性、定位、定量研究。
一、Brachet反应一显示细胞内的DNA和RNA
(一)原理
细胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后，其中的DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，呱咯宁染低聚分子的RNA呈红色。由此对细胞中的DNA和RNA进行定位、定性、和定量分析。
(二)方法
l．接种Hela细胞于盖片上并培养24～48小时，使长成单层。
2．取出盖片，用PBS(pH7.2)轻轻冲洗盖片表面去除残渣。
3．放入Carnoy固定液中固定l小时。
4．浸入甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液中30分钟染色。
5．取出盖片放入 蒸馏 水中轻轻漂洗2～3次(2～3秒钟左右)，吸去水分。放入纯丙酮中分色2～3秒钟。
6. 放入l／2丙酮+1／2二甲苯中5秒钟。
7．放入纯二甲苯中透明5分钟。
8．滴一滴中性树胶于载玻片上，将盖片标本面朝下封片。
9．镜下观察
（三）结果
细胞质被染成浅红色，细胞核被染成蓝绿色，而其中核仁被染成紫红色（参照照片）。
二、细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示
（一）原理
由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后，用不同pH值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。
（二）方法
1．以破坏脊髓法处死蟾蜍，将其腹面向上放人蜡盘中，剪开胸腔，打开心包。小心将心脏剪一小口，取心脏血一滴滴在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温晾干。
2. 将涂片作好标记放在70％乙醇中固定5分钟，室温晾干。
3．放入5％三氯醋酸中60℃30分钟，抽提出核酸。
4．清水冲洗多次（3分钟以上），以冲去痕迹的三氯醋酸。
5．滤纸吸干玻片上水分。
6. 一张片放入0.1％碱性固绿(pH8.0～8.5)中染色10～15分钟,另一张片放入0.1％酸性固绿(pH2.0～2.5)染色5～10分钟。
7．清水冲洗，盖上盖片镜检。