PEG介导的动物细胞融合(cell fusion)技术

实验五 PEG介导的动物细胞融合技术

细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)是指真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。人工的细胞融合开始于20世纪50年代, 60年代到70代作为一门新兴的技术, 发展非常快, 应用范围也极为广泛, 除了同种类细胞间可以融合, 种间远缘细胞也能融合, 细胞与组织不同, 不排斥异类、异种细胞, 动物细胞如此，植物细胞也是如此。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。

目前, 诱导细胞融合的方法有三种：病毒(Okada, 1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)(Pontecorvo, 1975)和电激(Zimermann, 1980s)。副粘病毒科的病毒，如副流感病毒(Sendai virus)和新城鸡瘟病毒，在其被膜中目前发现了两种糖蛋白。较大的一种具有粘附细胞和凝血的作用；较小的一种可介导病毒同宿主细胞融合, 也可诱导细胞与细胞融合，称为融合蛋白(fusion protein)。人工利用病毒诱导细胞融合即是利用病毒的这一特性, 使用时先用紫外线将病毒灭活, 稀释到一定浓度加入到细胞悬液中, 诱导细胞融合。但病毒介导细胞融合方法在使用前需要病毒的繁殖与灭活，操作繁琐，如灭活不完全则易对实验人员造成伤害，因此现在一般不使用此方法。后两种方法则是利用化学和物理手段，暂时使质膜脂类分子的有序排列发生改变，待去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便有可诱导相接触的细胞发生融合。总之，这3种方法都是在相互接触的两细胞进行自我修复过程中融合的。

细胞融合不仅可用于生物学的基础理论研究，而且在生产实践上还有重要的应用价值，如目前在单克隆抗体的制备, 核质关系, 体细胞的遗传和发育, 新品种的培养, 免疫作用, 疾病的治疗和性状的改良, 潜伏病毒的研究等，已取得了显著的成绩。 生物秀细胞实验论坛交流

实 验 目 的

 

1. 通过PEG介导的鸡血细胞融合实验, 对体细胞融合有一个清楚的概念

2. 并初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术

实 验 原 理

 

利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起, 使两细胞的胞质沟通, 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。

利用PEG介导细胞融合, 其融合效果受以下几种因素的影响。1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细, 一般采用的温度为38~40℃。

本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为: 1. 鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2. 实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。