蟾蜍骨髓细胞染色体观察
互联网
1.了解脊椎动物骨髓细胞染色体制片的一般方法；
2.观察蟾蜍骨髓细胞染色体的数目和形态
二 实验原理
染色体是基因的载体。真核细胞染色体数目和结构是重要的遗传指标之一，制备染色体标本无疑是细胞遗传学最基本的技术。优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。
染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。
a 小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。
利用骨髓的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。
另外，在骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或其它组织那样要经过体外培养。主要的中期相来自成红细胞系统，也来自各种骨髓母细胞，单核细胞和淋巴细胞的分裂相是较少的。
不过，在染色体制片上已无法区别上述来源。多倍体的中期相(4n,8n和16n)往往来自于巨核细胞。
b 对大型动物通常采用对路骨、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。
通过骨髓得到的染色体是比较简便的,一般也无需无菌操作。在临床上多用于白血病的研究。
在实验条件下，这种染色体是机体内真实情况的反映，因此在药品检验、环境监测、食品检验等工作以及致畸、致癌、致突变等研究中，利用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体的影响。
三 实验材料
蟾蜍
四 实验器具和药品
实验器具：解剖器具(剪刀、镊子、解剖刀)、2ml注射器、5号针头、10ml刻度
离心管
、吸管、试管、载玻片、离心机、显微镜、水浴锅。
实验药品：秋水仙素(0.01％)、乙醇、冰醋 酸、生理盐水，0.075%KCl低渗液
固定液：乙醇：冰醋酸＝3：1
五 实验过程
1．前处理：
两栖类是变温动物，因此气温低时，代谢慢，分裂相较少。所以一般在气温较高的季节做。如果气温较低时操作，可于实验前25℃预培养一周时间以提高蟾蜍的细胞活动性，增多分裂细胞相。取骨髓细胞前5－8小时向蟾蜍腹腔内注射秋水仙碱溶液。（每10克体重注入10-30μg秋水仙碱）。
2．取材：
以双毁髓方法处死蟾蜍剖出股骨，将股骨上的肌肉拧擦干净后，取骨髓细胞。先剪去股骨两端，再用2ml注射器和4号针头吸取生理盐水溶液1.5ml，将针头插入骨髓腔，以生理盐水将骨髓细胞冲入
离心管
中(注意冲出骨髓细胞的动作要快，冲击量大，细胞多，并要求预温药液至25℃)，后用小口吸管将细胞团吹打散开，最后加入预温至25℃的0.075%的KCl溶液加至6ml，置25℃条件下低渗20分钟。
3.制片：
3.1在骨髓细胞低渗液中加入1ml固定液(现用现配)，用吸管反复吹打，使细胞分散开。固定约10分钟。（25℃）
3.2离心：以1000转/分钟离心10分钟，去上清液，留0.5ml的细胞液于离心管底部。
3.3再固定：在离心管中加入5ml固定液，固定20分钟。
3.4再离心：以1000转/分钟离心8分钟，去上清液，留0.5ml的细胞液于离心管底部。
3.5制备细胞悬液：于上述离心管中加入3－5滴固定液（视细胞多少而定），吹打均匀，便制成了细胞悬液。
3.6滴片：取经处理干净的冷载玻片，用吸管取细胞悬液距离冷载玻片50cm以上的高度进行滴片，每张载玻片上1－3滴细胞悬液。
3.7干燥：空气中自然干燥或用酒精灯外焰烘烤致干燥。注意细胞悬液不可沸腾。
3.8染色：以改良苯酚品红染液染色15分钟
3.9镜检：倾倒染色液，用
蒸馏
水轻轻冲去剩余的染色液，并用吸水纸轻轻拭干载玻片，在显微镜下进行观察，统计蟾蜍细胞的染色体数目。
实验流程：预培养→预处理→取骨髓细胞→低渗、固定→离心→固定→离心→制备细胞悬液→染色观察
六 注意事项
1．秋水仙素水溶液为剧毒药品，操作时不要沾到皮肤上；
2．滴片时应采用冰冻冷载片，故实验前应首先进行载片的处理，放于冰箱中；
3. 要以一定高度进行滴片。
七 实验报告
1. 为什么滴片需要用冰冻的冷载玻片？
2．0.075M的KCl的作用是什么？
3．秋水仙素的作用是什么？
4．总结影响制片效果的因素。
