siRNAs在基因治疗中的应用

　　引言：小干扰RNAs(small interfering RNAs，siRNAs)是RNA干扰(RNA interference，RNAi)过程中的效应分子.Fire et al[1]在1998年向秀丽隐杆线虫中注射双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子后降解了细胞质中含有同源序列的靶mRNA.随后的研究表明，RNAi现象广泛存在于真菌、拟南芥、斑马鱼、果蝇、小鼠及大鼠等大多数真核生物中.早期在哺乳动物细胞中应用长dsRNA可引起非特异性干扰素反应而导致细胞死亡，后来遗传学和生物化学研究证明将dsRNA切割成21-28个核苷酸的siRNAs后不引起干扰素反应，并能有效降解含有同源序列的靶mRNA.因此，siRNAs正迅速发展成为研究基因功能的新工具和作为治疗的新手段.

　　1、siRNAs的沉默机制

　　siRNAs是由RNase-III家族中被称为Dicer的核酸内切酶在细胞质中剪切自然存在的长dsRNA的过程中产生的.Dicer将长dsRNA剪切为21-28个核苷酸的siRNA双链.这种siRNA双链除了在5’末端是磷酸，3’末端是羟基外，3’端还有由2个核苷酸构成的悬突.siRNA双链与诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)结合后裂解为siRNA单链，与siRNA单链完全互补结合的同源性靶mRNA被RISC剪切降解，从而达到基因沉默的目的.现在siRNA能够像核酶一样通过化学合成的方法或者通过载体表达双链短发夹样RNA(short hairpin-like RNA，shRNA)进入到细胞内，后者在细胞内可转化为siRNA而发挥基因沉默效应.一些研究证明siRNAs还有其他沉默机制，例如在几种生物中能够通过RNAi途径修饰细胞染色质导致转录水平的基因沉默[2-3].

　　miRNAs(microRNAs)是一类非编码小分子RNA，具有和siRNAs相似的功能，调节细胞内基因表达.成熟的miRNA是由胞质中70个核苷酸组成的发夹样结构前体剪切为21-22个核苷酸分子组成的单链.他们组装成蛋白复合体(miRNP)后在核糖体内与mRNA3’端非翻译区部分互补结合从而阻止mRNA的翻译.如果与同源性靶mRNA完全互补结合，那么miRNAs像siRNAs一样能够通过正反馈途径循环降解靶mRNA.

　　2、siRNAs的基因沉默效率及其安全性

　　各种基因沉默的方法是否能够高效作用于靶目标仍然是其应用于治疗的一个关键问题.Harborth et al[4]研究表明RNA结合蛋白，mRNA的二级结构和三级结构能够影响siRNA的沉默效率.绝大多数研究都证实siRNAs比各种寡脱氧核苷酸(oligodeoxyribonucleic acids，ODNs)更有效，并且作用时间更长.作用于同样的靶目标siRNAs的半数最大抑制浓度(IC50)比磷硫酰修饰的ODNs低100-1 000倍.尽管尚未对siRNAs与核酶和/或DNA酶的效率进行广泛地系统性比较，但Drew et al[5]研究表明siRNAs比核酶和/或DNA酶更有效，且具有长发夹结构的RNA比锤头结构的核酶能更强烈的抑制靶基因表达.

　　低浓度的siRNAs就能启动基因沉默的过程，因为他们能快速、特异性与RISC结合，从而减少了与非特异性蛋白结合的可能，这有利于减少siRNAs在治疗中的非特异性反应.事实上已有研究证明转染中等浓度的siRNAs并不引起全身非特异性反应[6].也有三项研究[7-9]认为siRNAs引起的非特异性反应与siRNAs的浓度、细胞类型、转染 试剂 以及siRNAs的转染方式有关.这些非特异性反应包括刺激基因亚型引起的干扰素反应，但研究并非像人们想象的那样，所产生的干扰素反应并不影响细胞生长.

　　3、siRNAs的表达载体

　　由于siRNAs既可以通过化学合成获得，也可以通过载体表达，这使具有靶向性的药物应用于基因治疗成为可能.表达siRNAs的载体通常含有RNA聚合酶III启动子(RNA polymerase III promoter，pol III)或RNA聚合酶II启动子(pol II)序列，首先转录生成与miRNA前体相似的shRNA，然后在细胞内变成siRNA发挥基因沉默效应.在活体内和培养组织细胞中应用表达siRNA的载体能够长时间整合到基因组中并“敲除”内源性基因.许多研究证明腺病毒载体、腺相关病毒(adeno-associated viral，AAV)载体、逆转录病毒载体及慢病毒载体都能有效转染到活体内和培养细胞中.Shinagawa et al[10]研究表明含pol II的表达载体能在体内产生由数百个碱基对构成的shRNA，而不诱导非特异性干扰素反应，这为siRNAs应用于哺乳动物提供了一种安全的新方法.