慢病毒载体构建及结构优化
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李振宇综述 徐开林 潘秀英审阅
徐州医学院附属医院血液科(徐州, 221002)
摘要 慢病毒载体目前是基因治疗中研究较多的载体, 与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较, 它有感染非分裂期细胞及容纳外源性目的基因片段大等优点。对其结构的优化主要集中在提高
生物
安全性、提高转基因表达、转基因表达的调控及载体靶向性等方面。本文介绍了慢病毒载体构建及结构优化方面的研究进展作一综述。
关键词 慢病毒载体; 载体构建; 结构优化
目前基因治疗中目的基因的转移工具多采用病毒载体, 其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为常用。由于逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞, 容纳外源基因的DNA 片段长度不超过8 kb; 腺病毒载体感染细胞时, 病毒DNA 游离在细胞核内, 并不整合到染色体上, 在体内不能实现稳定的长期表达, 且反复应用容易引起免疫反应。以人类免疫缺陷病毒21 (H IV 21) 来源的慢病毒载体越来越受到人们的重视[ 1 ]。研究发现慢病毒载体最大的特点是可以感染非分裂期细胞, 人们已成功地应用慢病毒载体感染了神经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞、视网膜色素上皮细胞、气道上皮细胞等。此外, 慢病毒载体容纳外源性目的基因的片段大, 可以在体内较长期的表达, 免疫反应小, 安全性较好。近来, 慢病毒载体的研究进展迅速, 但欲应用于临床尚需对其进一步加以改造, 以进一步提高
生物
安全性、提高目的基因的表达及调控目的基因的表达。
1 慢病毒载体的构建
1.1 构建原理[2 ]
慢病毒属于逆转录病毒科, 但其基因组结构复杂, 除gag、po l 和env 这3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外, 还包括4 个辅助基因, vif、vp r、 nef、vpu 和2 个调节基因tat 和rev[ 3 ]。H IV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒, 第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将H IV 21 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分: 包装成分由H IV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建, 能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白; 载体成分与包装成分互补, 含有包装、逆转录和整合所需的H IV 21 顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV ) 的可能性, 将包装成分的5′ L TR 换成巨细胞病毒(CMV ) 立即早期启动子, 3′ L TR 换成SV 40 po lyA 位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上, 即一个表达gag 和po l、另一个表达env。根据这个原理,N aldin i 和Kaf ri 等构建了三质粒表达系统[ 1, 4 ]。
1.2 三质粒表达系统
三质粒表达系统包括包装质粒、包
膜蛋白
质粒和转移质粒。其中包装质粒在CMV 启动子的控制下, 表达H IV 21 复制所需的全部反式激活蛋白, 但不产生病毒包
膜蛋白
及辅助蛋白vpu; 包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G 蛋白(V SV 2G) , 应用 V SV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围, 而且增加了载体的稳定性, 允许通过 高速离心对载体进行浓缩, 提高了滴度; 转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列, 还保留 350 bp 的gag 和RRE, 并在其中插入目的基因或标志基因(绿色荧光蛋白GFP)。将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少, 减少载体重组过程中产生RCV 的可能性。通过三质粒共转染293T 细胞, 超速离心后病毒滴度可达10
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IU /m l。
1.3 四质粒表达系统
为了减少H IV 21 包装结构的序列同源性, 进一步减少重组成RCV 的可能性,Du ll[ 5 ]等人将辅助基因去除。但由于gag2po l 的转运需要rev, 因此, 在上述的三质粒系统的基础上, 构建成四质粒表达系统, 该系统加上含rev 的质粒减少了产生RCV 的可能性, 而且对非分裂期细胞转导效率无影响。
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