慢病毒载体介导的肝细胞基因转移
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【摘要】 慢病毒(lentivirus) 具有可以感染低分裂细胞的独特优势,且基因转移效率高,操作相对简便,在多种疾病的基因治疗、转基因动物的制备等方面成为引人瞩目的病毒载体。本文就慢病毒载体(lentiviral vector ,LV) 的特点、构建、应用,尤其是慢病毒载体对于肝细胞的基因转移进行综述。
【关键词】 慢病毒载体;肝细胞
一、慢病毒载体
(一) 慢病毒载体概况
慢病毒是逆转录病毒科的一个亚科,包括灵长类慢病毒和非灵长类慢病毒,前者包括人类免疫缺陷病毒I 型( human immunodeficiency virus , HIV2 1) 、HIV22 、猴免疫缺陷病毒(SIV) ;后者包括猫免疫缺陷病毒(FIV) 、牛免疫缺陷病毒(BIV) 、马感染性贫血病毒( EIAV) 等。慢病毒为RNA 双链分子,共有9 个基因,其中包括与简单逆转录病毒相同的 gag、pol 、env 基因,它们编码病毒的基本结构,其中 gag 基因编码病毒的核心蛋白,pol 基因编码病毒所需要的酶,env 基因编码决定病毒感染靶向性的
膜蛋白
。此外,还包括2 个调节基因( tat 、rev) 及4 个辅助基因(vif 、vpr 、vpu、nef) [1 ] 。
目前认为,大多数情况下,慢病毒像其它逆转录病毒一样,其基因组经逆转录后能整合在宿主DNA 上,因此可将其改建为有用的外源基因的转移载体。病毒载体经改构后,不在宿主细胞内繁殖,不会导致宿主细胞死亡,被感染的或转化的动物细胞能连续传代,因此可利用慢病毒作载体改变动物细胞的基因型,并遗传到子代。
慢病毒载体最大的特点是在感染分裂期细胞的同时,还可以感染非分裂期细胞,并可在宿主体内长期表达,且不易诱发宿主免疫反应,安全性好。此外,由于慢病毒有强大的包装能力,一般认为可达8 ～10kb ,因此适用于多基因表达系统。与致癌逆转录病毒相比,慢病毒基因组包含较少的Cp G二核苷酸,这使得慢病毒对基因沉默有更强的抵抗力,从而更有利于外源基因在宿主内的表达。同时,慢病毒在整合时,并不倾向于转录的起始位点,而是在基因的整个转录区域都可以整合,整合的慢病毒对启动子的激活机会更低。所以,与其它致癌逆转录病毒载体相比,慢病毒载体更不易引起插入突变[2 ] 。基于以上优点,慢病毒载体在基因治疗中的应用已引起越来越多的关注。
(二) 慢病毒载体的构建第一个LV 系统是以HIV21 为基础构建的,其构建原理是将HIV21 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分:包装成分由HIV21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白;载体成分含有包装、逆转录和整合所需的HIV21 顺式作用序列,与包装成分互补,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为了进一步降低两部分同源重组产生有复制能力病毒的可能性,在这种二质粒表达系统的基础上,Naldini[3 ]和Kaf ri[4 ]等人构建了三质粒表达系统,即整个LV 系统由包装质粒、包膜质粒和载体质粒三种质粒组成。用水疱性口炎病毒G 蛋白( vesicular stomatitis virus ,VSV2G) 代替 HIV 本身的包 膜蛋白 ,扩大了载体的感染谱[5 ] ,增加了LV 的稳定性并提高了LV 的滴度。此后,缺乏HIV21 增强子及启动子序列的自失活性LV[6 ] 、可调控的LV(主要是四环素可诱导系统) [7 ]相继构建成功,进一步提高了LV 的安全性,扩大了LV 的应用范围。
二、慢病毒载体对肝细胞的基因转移
对于影响到代谢功能的多种遗传性疾病,肝脏指导的基因治疗都是一种有效的治疗手段。研究表明,LV 对肝细胞有很高的转导效率。在相关疾病的基因治疗方面有很大的应用前景。
(一) LV 对肝细胞的基因转移及在相关疾病治疗中的作用
多项体外实验及在动物模型中进行的间接回体 (ex vivo) 和体内(in vivo) 实验均表明,肝细胞对LV 介导的基因转移易感,且转入的外源基因可长期表达。Zahler MH[8 ] 等研究发现,原代培养的胎儿肝细胞可以以30 %～40 %的效率被携带绿色荧光蛋白基因的LV (LV2GFP) 转导。同样的细胞经X 射线照射后,细胞复制减少,但LV 介导的基因转移未受影响。经多次传代后,细胞中仍有GFP 表达。当表达GFP 的细胞植入Balb/ C 严重联合免疫缺陷 (severe combined immunodeficiency disease ,SCID) 小鼠肝脏后,在整个实验过程中(3 周) 小鼠肝脏中均有GFP 表达。利用肝成纤维细胞,在大鼠中的研究得到了相似的结果。当利用肝脏特异的白蛋白增强子/ 启动子时, GFP 在大鼠[9 ]的肝脏中可长期稳定表达。同时, 将携带人凝血因子IX 的LV 注入 SCID 鼠体内,可得到治疗水平的人凝血因子IX ,并稳定表达一年[10 ] 。LV 经过改造在体外可有效转导原代培养的大鼠肝细胞、Hep G2 肝癌细胞[11 ]和原代培养的人肝细胞[12 ] 。将经LV 转导的人肝细胞植入SCID 小鼠肝脏后,人肝细胞可以在小鼠的肝脏中存活并保持分化和有功能表型。
动物实验及细胞水平的研究结果也为LV 介导的外源基因在肝脏疾病治疗方面的应用提供了有利支持。最近,Nguyen TH[13 ]等研究发现,向2 天龄的Gunn 大鼠(高胆红素血症模型) 体内注射携带人葡萄糖醛酸转移酶基因且在肝脏特异的甲状腺激素结合蛋白启动子控制下的LV 6 周后,处理组胆红素完全正常且正常水平一直保持到142 周,而对照组则仍保持较高的胆红素水平。处理组大鼠的胆汁中存在大量的结合胆红素、PCR 和Western 检测证实在肝脏中存在并表达人葡萄糖醛酸转移酶,大约有40 %的肝细胞被转导,肝外组织则仅在一些动物的骨髓中检测到人葡萄糖醛酸转移酶的表达。 Nash KL[14 ]等也发现携带乙肝S 基因反义RNA 的 LV 转导表达HBV 的肝细胞后,可在一个较长的时期内(4 个月) 发挥抗HBV 作用。
