免疫双扩散检测抗GFP血清抗体

[实验原理]
在溶液中的可溶性多价抗原与血清抗体相遇，当两者的比例适当时可以形成一种网状的不溶性的大分子复合物，这叫作免疫沉淀反应。当这样的抗原和相应的抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相对扩散时，在抗原与抗体的比例适当处会形成可见的沉淀线，这叫免疫双扩散实验，是免疫沉淀反应的一种。免疫双扩散常用于动物免疫效果的检测和血清抗体效价的测定。本实验使用的粗抗原是大肠杆菌表达的GFP的抽提物，抗体是GFP免疫兔子后得到的抗血清。

[ 仪器 、 试剂 和材料]
1、磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4
2、1.5%琼脂，PBS配置
3、兔抗GFP 血清
4、GFP粗提物
5、微波炉
6、恒温培养箱
7、载玻片
8、自制打孔器
9、小塑料盒
10、针头、牙签
11、“枪”、“枪头”

[实验操作]
1、1.5%琼脂的配制:pH 7.4的PBS 100mL中加1.5克琼脂，微波炉中小功率加热，使琼脂完全溶化。
2、取干净的载玻片，平放于实验台（台面要水平），将融化的琼脂趁热加在载玻片上（约加4mL），使琼脂铺满整个玻片的表面（注意勿使琼脂流出玻片之外）。令其在室温下冷却凝固。
3、将载玻片放在画好的打孔式样的样板上，用自制打孔器（内径2-3毫米）在琼脂上照样板打孔，做两朵“花”。用针头小心地将打好的孔中的琼脂挑出，当心不要碰伤了孔周围的琼脂。打好孔后，把凝胶的右下角切掉一小块，作为标记。
4、GFP抗原的稀释：用上次实验得到的GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀，加100mL的PBS使溶解，此为抗原的原液。取出原液15mL，在一小块封口膜上用PBS做系列的倍比稀释，直到稀释为1：16。
5、在左边一朵花的中央孔中加约15mL的免疫后兔 血清 ，周围孔加不同稀释度的GFP粗提物。右边的一朵花除中央孔中加免疫前的兔血清外其余的与左边的相同。加样时将每孔加满即可，注意不要使溢出孔外。
6、在小塑料盒中铺一块 滤纸 ，加少量水将 滤纸 浸湿，上面放两根牙签，将加好样的载玻片放在牙签上，盖好盒盖，放37℃温箱中过夜。

[实验结果的观察]
将载玻片从塑料盒中取出，在散射光的背景下（载玻片后方约15厘米处用手或深色物挡住）观察，或在特殊的装置上观察，在左侧的 抗体 孔与适当稀释的抗原孔之间可见白色的沉淀线，而右侧的对照则无。如果将载玻片放在紫光灯下观察，沉淀线会发出绿色荧光，这说明抗原- 抗体 复合物中含有GFP。