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淋巴细胞增殖功能的测定

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  (一) 原理
  T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体,在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA),抗CD2、抗CD3 McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖;而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体(SAC)、脂多糖(LPS,对小鼠有作用)则刺激B细胞发生增殖;美洲商陆(PWM)、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。最近发现,integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。目前临床上最常选用 PHA刺激 PBMC, 根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入率测定T细胞的增殖水平。
  (二) 操作步骤
      无菌从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC)
      洗涤后用10%FCS RPMI1640调整细胞数为1~2×106/ml
                 ↓
      加入96孔培养板中,1~2×105细胞/100μl/孔,每组设3孔。
      加入最适剂量PHA,100μl/孔,同时设不加PHA阴性对照。如观察细
      胞因子(如IL-2)或其它刺激物(PMA)对增殖功能的调节作用,则根据
      加入因子的浓度而确定加入量,一般每孔最终体积为200μl
                 ↓ 37℃、5% CO2孵育,66h
        每孔加入0.5~1μci 3H-TdR(50μl)
                 ↓ 继续培养6~12h
         用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品
         于"9999"型玻璃纤维滤纸上
                 ↓
            烤干后β液闪仪计数

  计算
  1. 增殖水平直接用CPM值表示。
  2. 也可用刺激指数(SI)表示:
            PHA(或实验组)cpm-机器本底
         SI=───────────────
             阴性对照组cpm-机器本底
  (三)  试剂 和器材
  1. PBMC或其它含淋巴细胞的悬液。
  2. PHA或其它有丝分裂原、刺激物
  3. 闪烁液 PPO(2,5-二苯茎恶唑)3~5g
        POPOP[1,4双(5苯基恶唑)苯] 0.3~0.5g溶于1000ml二甲苯中。也可将POPOP加入少量二甲苯在37℃ 水浴 上溶解后,再加PPO,然后补足二甲苯。
  4. 3H-TdR,一般临用时稀释
  5. 10%FCS RPMI1640, CO2孵箱
  6. 细胞收集仪,β 液闪仪
  (四) 注意事项
  1. 注意无菌操作。
  2. PHA、ConA、PWM、LPS等在正式实验前均需摸索最适剂量或亚适剂量。犛I于厂家和批号不同丝裂原作用常有很大差别,如Wellcome公司PHA终浓度最适剂量为1~3μg/ml,而广州医工所PHA约为20~100μg/ml。
  3. 根据实验需要,对不同种(人、小鼠、大鼠、兔、狗等)不同来源淋巴细胞(胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃腺、外周血等)均应进行最适细胞浓度、犈`养时间和刺激物浓度的摸索。
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