酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化作用相结合而发展起来的一种免疫标记技术，既可用于组织、细胞内抗原的检测，又可用于体液中抗原抗体的检测。根据检测方法的不同，可将酶联法分为双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法和其他ELISA，现介绍前三种。
1. 双抗体夹心法　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，将已知抗体包被于微孔条上，加入待检品（抗原）形成抗原抗体复合物，加酶标抗体与之结合，经显色后用酶标仪测定OD值，从而测定相应抗原含量。
（1）以pH9.6碳酸盐缓冲液稀释已知抗体包被酶标板，4℃过夜。市售商品往往已经预先包被好已知抗体。
（2）将酶标板、试剂等平衡至室温，分别于相应孔内加入待检样品、阴性对照、阳性对照50μl。
（3）分别在每孔内滴加酶标抗体50μl。置37℃温育60min。室温平衡5min，甩干孔内液体，洗液洗涤5次，拍干。
（4）每孔加显色剂，37℃避光温育10min。
（5）每孔加终止液50μl，轻拍混匀。
（6）酶标仪测定OD值，用空白调零。样本OD值/阴性OD值（S/N）≥2.1（同时待检杯OD＞0．10）判为阳性。
2. 间接法　间接法是检测抗体最常用的方法， 将已知抗原吸附于固相载体，加待检血清（抗体）形成抗原抗体复合物，经孵育、洗涤后，加酶标抗体使之与抗原抗体复合物结合，经显色后用酶标仪测定OD值，从而间接测定相应抗体含量。步骤如下：
（1）以pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释已知抗原包被酶标板，4℃过夜。市售商品往往已经预先包被好已知抗原。
（2）在预包被已知抗原酶标板内加入待检样品、阴性对照、阳性对照50μl。置37℃温育25～45 min。用洗液洗涤5次，拍干。
（3）分别在每孔内滴加酶标抗体100 μl。置37℃温育25～30min，洗涤。
（4）每孔加显色剂，轻拍混匀，37℃避光温育10min。
（5）每孔加终止液50μl。
（6）酶标仪测定OD值，用空白调零。样本OD值/阴性OD值（S/N）≥2．1（同时待检杯OD＞0．10）判为阳性。
3. 竞争法　竞争法既可用于抗原半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以抗原竞争法为例，将已知抗体吸附于固相载体，加一定量已知酶标抗原及待测抗原，使两者竞争与固相抗体结合，经洗涤，最后结合于固相抗体上的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。步骤如下：
（1）已知抗体包被酶标板，4℃过夜。
（2）测定管内加一定量酶标抗原和待检样品，对照管内只加相同量酶标抗原。温育，洗涤。
（3）分别于测定管、对照管内加一定量底物显色。
（4）用酶标仪测定对照管、测定管内OD值，用空白调零。通过对照管与测定管OD值之差，计算标本中待测抗原含量。
进行ELISA操作时应注意以下几点：①实验室温度应控制在18℃～25℃；②加样须准确，同一样本设立对照管、测定管各两孔，取其平均值；③严格控制温育反应温度及时间，洗涤应充分；④结果判定应以 仪器 为准，肉眼仅作参考。