细胞杀伤活性检测技术
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细胞毒检测技术包括补体依赖细胞毒试验、NK细胞介导的细胞毒试验和特异性CTL活性检测，常用的实验技术有后两种。NK细胞（natural killer cell）是在天然免疫系统发挥主要作用的效应细胞，可直接杀伤病毒感染的靶细胞和某些肿瘤细胞。而细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）则是特异免疫系统发挥特异杀伤作用的效应细胞，可特异杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞。本节介绍乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NK细胞活性、Calcein释放实验检测CTL活性。
一、乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NK细胞活性
乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一。在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中，释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶I (NADH2），后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm或570nm波长处有一高吸收峰，利用读取的OD值，经过计算即可得NK细胞活性，步骤如下：
1．靶细胞制备 取培养24～48h的靶细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×10 5 ／ml，备用。
2．效应细胞的制备 常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×l0 7 ／ml。
3．效-靶细胞作用 将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T＝100∶1)加入40孔细胞培养板的孔中，每份标本设3复孔，同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组(0.1ml靶细胞＋0.1ml 1％NP-40液)，低速离心1000r／min，2min后，置37℃、5％CO 2 温箱中孵育2h。
4．酶促反应 取出培养物，吸取各孔上清0.1ml加于另一培养板孔中，置37℃预温10min，每孔加入新鲜配制的LDH底物溶液0.1ml，室温避光反应10～15min，每孔加入1mol/L柠檬酸终止液30μl，以终止酶促反应。
5．结果计算 用酶联检测仪在570nm波长下读取各孔OD值，并计算NK细胞活性。
NK细胞活性(％)=■×100％
二、Calcein释放实验检测细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocytes，CTL）活性
Calcein acetoxymethy1酯（Calcein-AM）是一种胞浆荧光标记物，本身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共育，再加Fluoro-Quench 试剂 （一种以Ca2+螯合的小牛血红蛋白主要成分、还含溴化乙啶 试剂 ，它对细胞无毒，不能进入活细胞但可能进入膜已破损的死细胞），淬灭培养液中的荧光，在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞对照孔（代表细胞100%存活）比较。即可计算效应细胞杀伤靶细胞百分比。本法简便可靠，无须收集和转移培养上清，重复性高，变异性小，测定数据自动输入计算机，适于大批量测定；可测CTL、LAK及NK细胞活性，还可在光学显微镜或荧光显微镜下直接观察细胞。步骤如下：
1． 靶细胞的标记 用5μmol/L Calcein AM 37℃ 水浴 30min进行标记。
2． 效-靶细胞作用 杀伤实验在圆底96孔培养板中进行。按E/T比例：50/1、25/1、12.5/1、6.25/1、3.13/1、1.56/1加入梯度稀释的效应细胞与标记好的靶细胞各l00μl/孔，每个比例3复孔。同时设自发释放组3复孔，完全释放组3复孔。效-靶细胞作用96孔培养板在37℃ 5％ CO2培养箱孵育4h后，3000r/min离心5min，将上清移入新的孔中。
3． 荧光检测 用荧光测量仪检测上清的荧光值(FI)，激发光为485nm，发射光为538nm。
4． 结果计算
杀伤率(％)=■×100%
一、乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NK细胞活性
乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一。在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中，释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶I (NADH2），后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm或570nm波长处有一高吸收峰，利用读取的OD值，经过计算即可得NK细胞活性，步骤如下：
1．靶细胞制备 取培养24～48h的靶细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×10 5 ／ml，备用。
2．效应细胞的制备 常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×l0 7 ／ml。
3．效-靶细胞作用 将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T＝100∶1)加入40孔细胞培养板的孔中，每份标本设3复孔，同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组(0.1ml靶细胞＋0.1ml 1％NP-40液)，低速离心1000r／min，2min后，置37℃、5％CO 2 温箱中孵育2h。
4．酶促反应 取出培养物，吸取各孔上清0.1ml加于另一培养板孔中，置37℃预温10min，每孔加入新鲜配制的LDH底物溶液0.1ml，室温避光反应10～15min，每孔加入1mol/L柠檬酸终止液30μl，以终止酶促反应。
5．结果计算 用酶联检测仪在570nm波长下读取各孔OD值，并计算NK细胞活性。
NK细胞活性(％)=■×100％
二、Calcein释放实验检测细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocytes，CTL）活性
Calcein acetoxymethy1酯（Calcein-AM）是一种胞浆荧光标记物，本身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共育，再加Fluoro-Quench 试剂 （一种以Ca2+螯合的小牛血红蛋白主要成分、还含溴化乙啶 试剂 ，它对细胞无毒，不能进入活细胞但可能进入膜已破损的死细胞），淬灭培养液中的荧光，在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞对照孔（代表细胞100%存活）比较。即可计算效应细胞杀伤靶细胞百分比。本法简便可靠，无须收集和转移培养上清，重复性高，变异性小，测定数据自动输入计算机，适于大批量测定；可测CTL、LAK及NK细胞活性，还可在光学显微镜或荧光显微镜下直接观察细胞。步骤如下：
1． 靶细胞的标记 用5μmol/L Calcein AM 37℃ 水浴 30min进行标记。
2． 效-靶细胞作用 杀伤实验在圆底96孔培养板中进行。按E/T比例：50/1、25/1、12.5/1、6.25/1、3.13/1、1.56/1加入梯度稀释的效应细胞与标记好的靶细胞各l00μl/孔，每个比例3复孔。同时设自发释放组3复孔，完全释放组3复孔。效-靶细胞作用96孔培养板在37℃ 5％ CO2培养箱孵育4h后，3000r/min离心5min，将上清移入新的孔中。
3． 荧光检测 用荧光测量仪检测上清的荧光值(FI)，激发光为485nm，发射光为538nm。
4． 结果计算
杀伤率(％)=■×100%
