用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用

【基本原理】
转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的谷丙转氨酶（Glutamic Pyruvic Transaminase ,GPT）活性较高，它催化如下反应：
α—酮戊二酸 + 丙氨酸 谷氨酸 + 丙酮酸
本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。
纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，能吸收20~22 %的水。而且其中6~7 %的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合，在一般情况下很难脱去，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱。所以纸层析是以滤纸纤维结合水作为固定相，以有机溶剂作为流动相。在用纸层析法分离氨基酸时，由于各种氨基酸在此二相中的分配系数不同，各有一定的迁移率。极性弱的氨基酸，易溶于有机溶剂即分配系数小，随流动相移动较快，Rf值大；而极性强的氨基酸相反，据此可以分离鉴定氨基酸。
本实验用圆滤纸进行水平型层析，除待测液外，点加对照液和标准液，层析后用茚三酮法显色，对此观察色斑，判定结果。
【器材】
玻璃匀浆器、离心管、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、10cm圆滤纸、吹风机、手术剪刀。
【 试剂 】
1．0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。
2．0.2mol/L Na ₂ HPO ₄ 溶液81ml与0.2mol/L NaH ₂ PO ₄ 溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。
3．0.1mol/L丙氨酸溶液
称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔细调至pH7.4后, 加磷酸盐缓冲液至100ml。
4． 0.1mol/Lα－酮戊二酸
称取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后，加磷酸盐缓冲液至100ml。
5．0.1mol/L 谷氨酸溶液
称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至50 ml。
6．0.5%茚三酮溶液
称取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。
7．层析溶剂
酚：水= 4：1（V/V）混匀备用。现用现配。
【基本操作】
1．匀浆制备：取新鲜动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液1.0 ml,迅速研成匀浆,用上述缓冲液3.5ml混匀备用。
2．酶促反应过程
（1）取 离心管 两支，编号：1（测定管）、2（对照管），各加肝匀浆0. 5ml。把对照管放沸水浴中加热5分钟，取出冷却。
（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液1.5 ml,摇匀。
（3）37℃保温，1小时后取出。