离子交换柱层析分离核苷酸

一、目的：
学习离子交换柱层析法分离核苷酸的原理及方法。
二、原理：
离子交换作用一般指在固相和液相之间发生的可逆的离子交换反应，它可用于分离各种可解离的物质。通常离子交换剂是在一种高分子的不溶性母体上引入若干活性基团。这样人工会成的离子交换剂具有各种各样的性能。作为不溶性母体的离分子有树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖或无机聚合物等，引入的活性基团可以是酸性基团，如强酸型的含有磺酸基（—SO ₃ H）、中强酸型的含磷酸基（—PO ₃ H ₂ ）、亚磷酸基（—PO ₂ H）、弱酸型的含有羧基（—COOH）或酚羧基（—OH）等。也可以是碱性基团，如强碱型的含季铵[—N ⁺ (CH ₃ ) ₃ ]、弱碱型的含叔胺[—N(CH ₃ ) ₂ ]、仲胺（—NHCH ₃ ）、伯胺（—NH ₂ ）等。
在一定条件下，离子交换树脂吸附的物质数量和在溶液中的物质数量达到平衡时，两者数量之比叫分配系数（平衡常数）。理想的情况是洗脱曲线和分配系数相符合，待分离的各种物质的分配系数，应有足够的差别，以Kd表示分配系数：
式中 M _s 和 M _l 分别代表单位重量离子交换树脂和单位体积溶液中溶质的摩尔数。当有A、B两种溶质进行离子交换柱层析时，吸附在离子交换树脂上的溶质为高浓度的竞争性离子所交换并被洗脱下来。溶质的迁移速度与分配系数成反比，因此由原点到A、B两种物质波峰间距离的比值决定于它们分配系数的比值。各波峰的幅度和形状由柱长及其他因素（如交换树脂颗粒的大小形状、交联度、流速等）所决定。

溶质的分配系数不仅与其电荷有关，也受到它与离子交换树脂的非极性亲和力以及两者之间的空间关系等因素的影响。
在一定条件下，离子交换树脂对不同单核苷酸的吸附能力是不同的，因此选择适当类型的离子交换树脂，控制吸附及洗脱的条件便可分离各种单核苷酸。
为了增加单核苷酸在离子交换树脂上的吸附能力，需要：（1）控制条件，使单核苷酸带上大量相应的电荷。这主要是通过调节pH值，使单核苷酸的一些可解离基团（磷酸基、氨基、烯醇基）解离，四种单核苷酸相对分配系数与pH的关系如图14-1。（2）减少上柱溶液中除单核苷酸外的其它离子的强度。洗脱时则相反：使被吸附的单核苷酸的相应电荷降低；增加洗脱液中竞争性的离子的强度，必要时提高温度使离子交换树脂对单核苷酸的非极性吸引作用减弱。
RNA可被碱水解成2＇-或3＇-核苷酸。可利用阳离子交换树脂（聚苯乙烯—二乙烯苯，磺酸型）或阴离子交换树脂（聚苯乙烯—二乙烯苯，季铵碱型）分离单核苷酸。本实验利用强碱型阴离子交换树指（强碱型201×8、强碱型201×7、国产717、Dowex1、Amberlite IRA—400或Zerolit FF等）将各类核苷酸分开，测定核苷酸的紫外吸收光谱的比值：O．D ₂₅₀ /O．D ₂₆₀ 、O．D ₂₈₀ /O．D ₂₆₀ 、O．D ₂₉₀ /O．D ₂₆₀ 对照标准比值（表14-1），可以确定其为何种核苷酸，同时也能算出RNA中核苷酸的相对摩尔比。