水稻萌发及幼苗期淀粉酶和过氧化氢酶活性测定

实验目的：淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性较强。水稻萌发时淀粉酶活性最强。水稻萌发时淀粉活性的大小与种子萌发力有关。过氧化氢酶也普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定联系。本实验通过对水稻萌发期淀粉酶活性测定以及对幼苗期过氧化氢酶活性的测定，学习和掌握淀粉酶和过氧化氢酶的测定方法，了解水稻生长与之代谢的关系。

Ⅰ 淀粉酶活性的测定
一、原理
淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸试剂还原成3-氨基-5-硝基水杨酸的橙红色化合物，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。以5分钟内每克样品水解产生麦芽糖的毫克数表示酶活性的大小。
植物淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，其中β-淀粉酶不耐热，在温度70℃以上易钝化：而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。根据以上特性，可分别测定这两种淀粉酶的活性。如测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性，即为淀粉酶总活性。
二、实验材料、 仪器 及试剂
1． 仪器 ：
20ml具塞试管 移液管 100ml容量瓶 石英砂 研钵
721型分光光度计 离心机 恒温水箱 离心管
2． 试剂 ：
（1）1%淀粉溶液：称1.0克可溶性淀粉，加入100ml蒸馏水煮沸。（临用时配制）
（2）pH5.6柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸21.0克，溶解后定容至1000ml；B、称取柠檬酸钠29.4克，溶解后定容至1000ml；量取A液55ml与B液145ml混匀，即为pH5.6的缓冲液。
（3）0.4mol/L氢氧化钠溶液。
（4）3,5-二硝基水杨酸 试剂 ：取1.0克3,5-二硝基水杨酸，溶于20ml mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖，勿使二氧化碳进入。
（5）麦芽糖标准溶液：称取0.1000克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，然后定容至100ml，取为1mg/ml麦芽糖标准液。实验材料：萌发水稻种子。
三、实验方法
1．酶液的制备：称取去根萌发水稻种子2克（含外壳），置研钵中，加1克石英沙研磨成匀浆。用8ml蒸馏水分次洗涤研钵，将匀浆转入 离心管 中，搅拌均匀后放置15～20分钟（间隔搅拌2～3次）。3500rpm离心10分钟，将上清液转入100ml容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，得粗酶液。
2．α淀粉酶与β-淀粉酶的酶促反应：
取4支10ml具塞刻度 试管 ，编号，按下表加入各液：

将以上各管混匀后，置40℃水浴准确保温5分钟，取出后立即向3、4号 试管 中加入4ml 0.4mol/L NaOH终止酶活性。
3．麦芽糖的测定：
（1）标准曲线制作：取20ml 刻度试管7 支，编号，分别加入1mg/ml 麦芽糖标准液0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0ml，然后各管加蒸馏水，使体积均达2ml，再向各管加3，5-二硝基水杨酸试剂2ml，置沸 水浴 中煮沸5分钟，取出后冷却，用蒸馏水稀释至20ml，摇匀后在520nm波长下用分光光度计比色，以光密度值为纵坐标，麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。
（2）样品的测定：取以上酶作用后的反应液及对照管中的溶液各2ml，分别放入20ml具塞刻度试管中，加入2ml3，5-二硝基水杨酸试剂，置沸 水浴 中准确煮沸5分钟，取出冷却，用 蒸馏 水稀释至20ml，摇匀在520nm波长下用分光光度计比色，记录OD值，从麦芽糖曲线中查出相应麦芽糖含量，进行结果计算。
四、结果计算

A—为酶反应管中麦芽糖含量，即3，4号管中麦芽糖毫克数的平均值。
A′—为对照管中麦芽糖含量，即1，2号管中麦芽糖毫克数的平均值。