结晶乳酸脱氢酶的制备
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一、实验目的
1.了解乳酸脱氢酶的生理作用。
2.掌握乳酸脱氢酶分离纯化的方法与步骤。
二、实验原理
DH 是一种普编存在的与代谢有关的酶。哺乳动物LDH 由两个不同的亚基结合组成，以五种四聚体的同工酶存在。这些同工酶在催化、物理和免疫性能方面是不同的。亚基以”H”和”M”表示，形成H 4 ，M 4 ，H 3 M，H 2 M 2 和HM 3 。在心肌中”H”亚基占优势，心肌适合于丙酮酸的需氧的氧化。在骨胳肌和肝中”M”亚基占优势，它与厌氧代谢和丙酮酸还原有较大关系。
三、 仪器 、原料和试剂
仪器
绞肉机，冷冻离心机，透析袋，冰水浴，冰箱，纱布，滤纸等。
原料
为猪或牛心，从已宰动物身上取出，立即用冰保藏，运回后，马上操作。
试剂
磷酸钙凝胶(现配现用)：4kg 滤碎心肌抽提液所需凝胶量制备如下：1L0.44moL／L 磷酸氢二钠在搅拌下，快速加入至1L0.66mol／L 氯化钙。混合物加浓氨水(需25~28mL)以调pH 至8.2~8.6，并用大量水洗涤至洗涤的水不含氯离子(通常用20- 25L 洗5、6 次；前几次用自来水)。凝胶悬浮于3L 水
中，冷至5℃。以下操作，包括离心，在5℃下进行。
四、操作步骤
1.酶的吸附与洗脱
整理好的肌肉在一细孔绞肉机中绞碎，再用少量水在组织捣碎器内捣30秒。每批4kg 碎肉浆和10L水搅拌15~30分钟。两层纱布过滤，然后，重新用5L 水抽提。再次挤干后，合并红色浑浊抽提液(容积约14.5L)并与磷酸钙混胶混合。搅拌l0分钟后，凝胶放置，使沉淀，倒去上清液后，离心(600×g，15分钟)收集凝胶。用1.3L0．2moL/L 磷酸缓冲液(pH7.0)洗脱酶。凝胶离心(600×g，15分钟)取出，并用600mL 磷酸缓冲液搅拌1次。再离心以后弃去凝胶。
2.纯化
合并洗脱液(容积约1.9L)用固体硫酸铵(42g/100mL 洗脱液)处理，所得沉淀离心(1400×g，1.5小时)。或者用0.40硫酸铵溶液加到125mL，沉淀用折叠滤纸过滤。约需6一12小时，在冰库过滤，过夜。
沉淀溶于200mL0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)中，产生棕色溶液约325mL。不溶物离心除去。冷却至0℃，加入0.6倍容积的冷(-15℃)丙酮，混合物放置l0℃10分钟。离心(1400×g，30分钟)，沉淀常常在两层当中形成。小心倾去液体，沉淀和140mL0．21硫酸铵搅拌10分钟。悬浮液离心(1400×g，30分钟)，上清液(容积约140mL)用固体硫酸铵(13g/100mL)处理。离心(10000×g，15分钟)，沉淀溶于水，得35~45mL 黄色溶液。冷至0℃并与0.6倍容积丙酮(-15℃)混和。混合物在20℃放置10分钟，离心(1400×g，1小时)；或10000×g，10分钟。沉淀充分地分散在21％硫酸铵中，最终容积为15~20mL，所得悬浮液对1L 0.2l 硫酸铵透析12小时。
3.结晶
透析袋 内溶液离心(10000×g，15分钟)；得到几乎无色的清溶液，用固体硫酸铵(40mg/mL)在离心杯内处理，并立即离心(20000×g，0℃，3分钟)。上清液可能稍浑，倒入另一个杯内，10分钟滴加室温饱和硫酸铵直至加入量相当于0.1mL/0.1mL 酶液。置5℃，1或2小时，结晶离心(10000×g，20分钟)收集。
4.重结晶
把结晶溶于最小量的0℃水中，在5~10℃搅拌下，用20分钟加固体硫酸铵(350mg/mL)。产量约20一30mg(3次重结晶品)。结晶可溶于7~21％硫酸铵或0.2mol/L 磷酸 缓冲液 (pH7.4)中，并保存于0℃。结晶形状为细针状。上述溶液放置6~8周不丧失活失。结晶酶较原肌肉抽提液活力提高90~130倍。
1.了解乳酸脱氢酶的生理作用。
2.掌握乳酸脱氢酶分离纯化的方法与步骤。
二、实验原理
DH 是一种普编存在的与代谢有关的酶。哺乳动物LDH 由两个不同的亚基结合组成，以五种四聚体的同工酶存在。这些同工酶在催化、物理和免疫性能方面是不同的。亚基以”H”和”M”表示，形成H 4 ，M 4 ，H 3 M，H 2 M 2 和HM 3 。在心肌中”H”亚基占优势，心肌适合于丙酮酸的需氧的氧化。在骨胳肌和肝中”M”亚基占优势，它与厌氧代谢和丙酮酸还原有较大关系。
三、 仪器 、原料和试剂
仪器
绞肉机，冷冻离心机，透析袋，冰水浴，冰箱，纱布，滤纸等。
原料
为猪或牛心，从已宰动物身上取出，立即用冰保藏，运回后，马上操作。
试剂
磷酸钙凝胶(现配现用)：4kg 滤碎心肌抽提液所需凝胶量制备如下：1L0.44moL／L 磷酸氢二钠在搅拌下，快速加入至1L0.66mol／L 氯化钙。混合物加浓氨水(需25~28mL)以调pH 至8.2~8.6，并用大量水洗涤至洗涤的水不含氯离子(通常用20- 25L 洗5、6 次；前几次用自来水)。凝胶悬浮于3L 水
中，冷至5℃。以下操作，包括离心，在5℃下进行。
四、操作步骤
1.酶的吸附与洗脱
整理好的肌肉在一细孔绞肉机中绞碎，再用少量水在组织捣碎器内捣30秒。每批4kg 碎肉浆和10L水搅拌15~30分钟。两层纱布过滤，然后，重新用5L 水抽提。再次挤干后，合并红色浑浊抽提液(容积约14.5L)并与磷酸钙混胶混合。搅拌l0分钟后，凝胶放置，使沉淀，倒去上清液后，离心(600×g，15分钟)收集凝胶。用1.3L0．2moL/L 磷酸缓冲液(pH7.0)洗脱酶。凝胶离心(600×g，15分钟)取出，并用600mL 磷酸缓冲液搅拌1次。再离心以后弃去凝胶。
2.纯化
合并洗脱液(容积约1.9L)用固体硫酸铵(42g/100mL 洗脱液)处理，所得沉淀离心(1400×g，1.5小时)。或者用0.40硫酸铵溶液加到125mL，沉淀用折叠滤纸过滤。约需6一12小时，在冰库过滤，过夜。
沉淀溶于200mL0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)中，产生棕色溶液约325mL。不溶物离心除去。冷却至0℃，加入0.6倍容积的冷(-15℃)丙酮，混合物放置l0℃10分钟。离心(1400×g，30分钟)，沉淀常常在两层当中形成。小心倾去液体，沉淀和140mL0．21硫酸铵搅拌10分钟。悬浮液离心(1400×g，30分钟)，上清液(容积约140mL)用固体硫酸铵(13g/100mL)处理。离心(10000×g，15分钟)，沉淀溶于水，得35~45mL 黄色溶液。冷至0℃并与0.6倍容积丙酮(-15℃)混和。混合物在20℃放置10分钟，离心(1400×g，1小时)；或10000×g，10分钟。沉淀充分地分散在21％硫酸铵中，最终容积为15~20mL，所得悬浮液对1L 0.2l 硫酸铵透析12小时。
3.结晶
透析袋 内溶液离心(10000×g，15分钟)；得到几乎无色的清溶液，用固体硫酸铵(40mg/mL)在离心杯内处理，并立即离心(20000×g，0℃，3分钟)。上清液可能稍浑，倒入另一个杯内，10分钟滴加室温饱和硫酸铵直至加入量相当于0.1mL/0.1mL 酶液。置5℃，1或2小时，结晶离心(10000×g，20分钟)收集。
4.重结晶
把结晶溶于最小量的0℃水中，在5~10℃搅拌下，用20分钟加固体硫酸铵(350mg/mL)。产量约20一30mg(3次重结晶品)。结晶可溶于7~21％硫酸铵或0.2mol/L 磷酸 缓冲液 (pH7.4)中，并保存于0℃。结晶形状为细针状。上述溶液放置6~8周不丧失活失。结晶酶较原肌肉抽提液活力提高90~130倍。
