华勃氏呼吸计法测定L—谷氨酸

本实验通过 L-谷氨酸的测定学习华勃氏呼吸仪的使用方法。
二、实验原理
大肠杆菌菌体内含有L－谷氨酸脱羧酶，能专一的催化L－谷氨酸脱羧，释放出二氧化碳。华勃氏呼吸计法是一种微量检压技术，可用于测定微生物和组织代谢时所发生的气体量的改变，如氧的吸收和CO ₂ 的产生。在恒温、恒容情况下，如果华勃氏呼吸计所带瓶内气体的量发生改变，则引起压力的改变(如放出CO ₂ 时瓶内压力增加)，由测压计上压力的改变就可计算放出CO ₂ 的量(每分子L-谷氨酸产生一分子CO ₂ )，进一步求出L-谷氨酸的量。
三、 仪器 、原料与试剂
仪器
刻度吸管(2mL，0.5m，0.2m，0.1mL)、 注射器(2mL)、华勃氏呼吸仪1台(附测压管与反应瓶)。
原料
1.大肠杆菌丙酮粉的制备
将纯化的大肠杆菌由试管斜面培养接种到10支200mL茄形瓶培养基上，于37℃培养16~18小时。
2.培养基的配方如下：
蛋白：10g 牛肉膏浓缩液：5g
琼脂：20g 蒸馏水：1000mL
每一茄形瓶加入少量0.9％氯化钠溶液(生理盐水)，洗下菌体(可洗二次)，菌体悬液离心(2500rpm)弃去上清液，沉淀(菌体)悬浮于少量生理盐水中，置冰箱中冷却至20℃。
向己冷却的菌体悬液中加入10倍体积的冷丙酮(－10℃)边加边搅拌10分钟，静置，待菌体沉淀后，倾去上清液，菌体用布氏漏斗抽滤，并用冷丙酮洗菌体1~2次，滤液置真于干燥器内减压干燥，所得大肠杆菌丙酮粉装于密封瓶内，冰箱保存，数日内有效(现制备的要放入冰箱40小时后，取出研磨粉备用)。
试剂
1. 醋酸一醋酸钠缓冲液(pH5.0)：
A液：3M醋酸钠溶液：称取NaAC·3H2O(M＝136.09)40.8g溶于蒸馏水，然后定容至100mL。
B液：2M醋酸溶液：称取12g醋酸加蒸馏水定容至100mL。
将A、B两液按7：3(V/V)混合即得，使用时事先用pH计校正。
2. pH5.0 0.5M醋酸一醋酸钠缓冲液：称取30g冰醋酸加12g NaAC·3H2O产溶于100mL溶液瓶中，用蒸馏水稀至刻度。也可用3M醋酸缓冲液稀释制得。
3. 2％大肠杆菌脱羧酶液：称取2g大肠杆菌脱羧酶丙酮粉(制备方法附后)用pH5.00.5M的醋酸缓冲溶液定容至100mL。
4. 0.05mol/LL－谷氨酸溶液：准确称取L一谷氨酸0.7360g用蒸馏水定容至100mL。
5. 检压液(或称布洛的氏溶液)：
称取NaCl23g，牛胆酸钠5g，伊文氏兰0.lg(分子量960.83)，没有可以用0.lg甲基兰或酸性品红代替(呈色)。混合后再加麝香草酚兰酒精溶液数滴(防腐)(1g麝香草酚兰溶于100mL 40％酒精中)，用蒸馏水定容至500mL，比重为1.033，使用前需校正，若高于1.033时用蒸馏水调，低时用NaCL调。
四、操作步骤
l.将测压管与反应瓶洗净并在60℃下烘干，冷却后于各个磨口塞上涂上凡士林(最好用羊毛脂，真空油)。
2.将测压计固定在铁架上，放松螺旋压板，用注射器在橡皮管内加入检压液至刻度50mm处。
3.在反应瓶中加入各 试剂

按上表装好试样后，与同一号码的测压管连接；用凡士林油封好磨口处，用皮筋系平；注意关闭侧室通风孔。
4.于水箱内加入温水至离水箱上部6cm处事先用温水调至37℃左右，杆上华勃氏呼吸计的电源杆头，打开电源总开关，调节水银触点温度计至37℃刻度处，打开加热开关，同时开动 搅拌器 ，使 水浴 恒温在37℃。
5.将两幅(样品与对照)测压计，放在水槽侧内，固定在支架上，开动震荡器(120次/分左右)。